多细胞生物严密地协调自噬和细胞死亡，以维持发育、分化和许多细胞类型的稳态[1]。基于形态学、生化和分子机制差异，调节性细胞死亡主要分为凋亡形式和非凋亡形式[2]。铁死亡是一种非凋亡性细胞死亡，主要依赖于铁介导的Fenton反应和随后细胞内过量的脂质过氧化[3]。铁死亡损伤涉及多种病理情况，特别是癌症和组织损伤。GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）是system xc-的下游抗氧化酶，参与细胞膜中磷脂氢过氧化物的清除，从而对铁死亡具有细胞保护作用。抑制GPX4活性或下调GPX4表达可诱导铁死亡。虽然GPX4的抗铁死亡功能已被广泛研究，但GPX4的调控机制仍不甚清楚。

 

铜是人体生理必需的微量元素，其代谢的改变与多种疾病发病密切相关。在大量不同类型的癌症患者中，包括淋巴瘤、乳腺癌和肺癌，都观察到血清和肿瘤铜水平升高。并且，铜螯合对肿瘤发展和血管生成具有潜在的抑制作用[4]。然而，过量摄取铜也会导致细胞损伤和死亡。特别是，细胞内铜的超生理水平通过诱导活性氧(ROS)或抑制蛋白酶体功能来触发凋亡[5]。此外，细胞内铜的积累可能导致一种特定的细胞死亡方式，称为“铜死亡”，其不同于凋亡、坏死和铁死亡[6]。在以往的研究报道中，铜似乎可以通过几种依赖于环境而不同的死亡途径来杀死细胞，但铜是否调节铁死亡尚未明确。

该研究报道了铜在体外和体内促进铁死亡敏感性的新作用。首次证明了铜直接与GPX4蛋白结合，导致GPX4聚集体的形成和随后的GPX4自噬降解。另外还发现TAX1BP1（Tax1结合蛋白1）是GPX4蛋白降解的自噬受体。这些发现为自噬依赖性铁死亡的机制提供了新的见解。

 

 

为了确定铜是否调节铁死亡，作者使用铜螯合剂TM和TEPA处理四种胰腺癌细胞系Aspc-1、PANC-1、MIA PaCa-2和SW1990细胞，确定铜螯合剂TM和TEPA能够抑制铁死亡诱导剂erastin引起的细胞毒性（图1A）。并且，TM和TEPA对多种铁死亡诱导剂包括RSL3、erastin、ML162、ML210、SAS等诱导的细胞死亡均有抑制作用（图1B）。TM和TEPA只能抑制铁死亡而不抑制凋亡、坏死和碱死亡（图1C-F）。同时，作者发现TM和TEPA可以抑制erastin诱导的脂质过氧化，但对细胞内铁离子没有影响。与经典的铁死亡抑制剂liproxstatin-1和DFO不同，TM和TEPA在体外不具有抗氧化性，在体外也不能够结合铁离子。以上结果证明TM和TEPA可以抑制铁死亡。

 

图1 铜螯合剂TM,TEPA抑制铁死亡

（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）

 

作者在细胞培养基中添加铜离子之后，发现Cu²⁺会对低剂量的erastin处理造成细胞死亡(图2A)和脂质过氧化(图2B)，这一过程被铁死亡抑制剂Fer-1阻断(图2C)。当使用铁螯合剂DFO去除游离Fe²⁺时，向erastin中加入Cu²⁺并不能诱导细胞死亡(图2E)，说明Cu²⁺不能取代Fe²⁺介导Fenton反应(图2F)。作者进一步研究了Cu²⁺对GPX4蛋白表达的影响，结果显示，TM阻止了Erastin诱导的GPX4蛋白下调，而Cu²⁺则促进了GPX4蛋白下调(图2F,G)。同时，GPX4 mRNA水平不受影响(图2H,I)。重要的是，Cu²⁺联合erastin诱导了AsPC-1细胞GPX4蛋白的泛素化(图2J)，说明铜可能促进了GPX4蛋白的降解。既往研究表明，GPX4蛋白降解可通过蛋白酶体和自噬途径介导。随后作者发现只有自噬的抑制剂CQ可以阻止GPX4蛋白降解，而不是蛋白酶体BTZ(图2K)。铜还可以促进GPX4蛋白的多聚化(图2L)。因此，自噬可能参与了GPX4蛋白的降解。

 

图2 铜通过促进GPX4自噬降解促进铁死亡

（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）

 

作者推测自噬分子参与GPX4蛋白降解，作者发现铜和erastin的联合作用显著激活了自噬。此外，ATG5的下调也减弱了Cu²⁺联合erastin诱导的铁死亡（图3A）。紧接着作者发现Cu²⁺联合erastin选择性地增加了GPX4与TAX1BP1和SQSTM1的结合，但没有增加与其他自噬受体CALCOCO2、CCT2或OPTN的结合（图3B）。同时敲低TAX1BP1（而非SQSTM1/p62）抑制GPX4蛋白降解，并且降低了细胞对铁死亡的敏感性(图3C-E)。以上结果证明TAX1BP1是GPX4蛋白降解的关键自噬受体。

 

图3 TAX1BP1作为自噬受体降解GPX4

（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）

 

由于重金属诱导的ROS生成是细胞杀伤的重要机制，为了排除Cu²⁺介导的ROS生成参与这一现象的可能性，作者使用ROS清除剂NAC发现未能抑制Cu²⁺联合erastin诱导的GPX4聚集（图4A）。接下来，作者研究了Cu²⁺是否直接与GPX4结合以诱导GPX4聚集。为了验证这一假设，随后作者进行了基于重组GPX4蛋白荧光光谱的变化的研究，发现在Cu²⁺处理下GPX4发生了明显的光谱移位(从328 nm到334 nm)，这表明铜与GPX4之间可能存在直接的相互作用（图4B）。先前有研究发现Cu²⁺可与半胱氨酸残基相互作用，而GPX4中有两个表面可接近的半胱氨酸残基C107和C148，理论上可能与Cu²⁺结合。用丝氨酸残基取代这些半胱氨酸残基的位点定向突变表明，C107和C148都是Cu²⁺诱导的GPX4聚集在Cu²⁺联合erastin作用下发生的必要条件（图4C）。相比之下，未表面暴露的C75突变未能影响Cu²⁺诱导的GPX4蛋白聚集（图4C）。这些结果表明Cu²⁺选择性地与GPX4的半胱氨酸残基C107和C148结合。

 

图4 铜诱导的GPX4聚集依赖于GPX4的半胱氨酸残基

（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）

 

作者进一步探究了铜对裸鼠在体移植瘤中铁死亡的影响。与细胞实验中的发现一致，相比对照组，PANC-1异种移植到IKE治疗，铜增强了IKE治疗效果，这种效果被铁死亡抑制剂Lip-1逆转（图5A-C）。免疫组化染色结果显示，铜离子和IKE联合使用对GPX4水平的抑制强于单一药物治疗（图5D）。此外，联合治疗增加了肿瘤中4-HNE的水平，但没有增加Cleaved caspase 3的表达水平（图5D）。然而，铜并不能影响erastin诱导的TFRC和Fe²⁺水平（图5D），说明铜并不影响肿瘤中与铁死亡相关的铁代谢。作者还评估了铜在急性胰腺炎中的作用，通过实验证明：铜有助于铁死亡诱导的急性胰腺炎。综上，这些结果证实了铜可以在在体内促进铁死亡的发生。

 

图5 铜在体内增强了IKE的抗癌活性

（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）

 

图6 铜通过促进GPX4自噬性降解从而促进铁死亡

（图源：Qian Xue, et al., Autophagy, 2023）

 

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究揭示了铜离子的一种新的促铁死亡作用及机制，即铜离子与GPX4蛋白特定半胱氨酸残基的结合并促进依赖自噬受体TAXIBP1的GPX4自噬降解（图6）。作者的发现可能为通过给予额外的铜离子来增强癌细胞的铁死亡，以及通过铜离子螯合来抑制组织损伤性铁死亡提供潜在的治疗策略。