固定细胞中可以使用微管蛋白抗体进行Tubulin的染色。

01使用微管蛋白抗体（以Cat. # ATN02，https://www.univ-bio.com/anti-tubulin-polyab/ATN02-S.htmlAnti-Tubulin Polyclonal Ab(sheep host)为例）进行微管蛋白染色步骤

1) 取出含有细胞的盖玻片（细胞汇合度50%左右，可视细胞类型优化）；

2) 弃去培养基，用PBS轻轻洗一次细胞（室温）；

3) 将盖玻片转移到湿盒中，每张盖玻片上滴加100 µl固定液（甲醇），-20℃固定3min；

4) 用PBS轻轻冲洗细胞2次，每次30 s（室温）；

5) 每张盖玻片上滴加100 µl通透剂（含1% Triton X-100的PBS），于湿盒中室温通透10 min；

6）移除通透剂，加入100 µl含3% BSA的PBS封闭缓冲液，孵育30分钟

7) 用PBS轻轻冲洗1次细胞，每次30 s（室温）；

8) 每张盖玻片上滴加100-200 µl Anti-Tubulin Polyclonal Ab (sheep host)（1:500，封闭缓冲液稀释），于湿盒中室温孵育60 min或4℃过夜；

9) 使用含有1%Triton X-100的PBS轻轻冲洗细胞30 s；

10) 用PBST清洗盖玻片三次，每次孵育5 min（室温）；

11) 每张盖玻片上滴加200 µl荧光二抗（稀释比例参考对应抗体说明书）于湿盒中室温孵育30 min（尽量减少光照）；

12) 用PBS清洗盖玻片3次，每次5 min（室温）；

13) （可选）每张盖玻片上滴加200 µl DAPI（稀释比例和孵育时间参考对应说明书）,于湿盒中室温孵育5 min（尽量减少光照）；

14) （可选）用PBS冲洗盖玻片3次，每次30 s（室温）；

15) 用纸巾轻轻擦去盖玻片上的液体，然后倒置在载玻片上，滴一滴抗淬灭封片剂；

16) 静置20 min晾干，然后用指甲油封住每一面，4°C避光可保存24 h。

图2：使用微管蛋白抗体（ATN02）和DAPI通过IF检测Swiss 3T3 cells中的微管蛋白

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二、活细胞中的Tubulin染色步骤

活细胞中可以使用荧光标记的微管蛋白、特殊的荧光探针（如SPY555-Tubulin Probe或SiR-Tubulin Kit）进行Tubulin的染色。

01显微注射荧光标记的微管蛋白(以Cat. # TL440Mhttps://www.univ-bio.com/search.html?keyword=TL440M，Tubulin Protein (Fluorescent AMCA): Porcine Brain为例)进行微管蛋白染色步骤。

1) 短暂离心，使荧光标记微管蛋白集中在小瓶底部；

2) 将荧光标记微管蛋白和无菌水置于冰上

3) 使用5ul冰的无菌水重悬荧光标记微管蛋白；

4) 将溶液吸入注射针中；

5）向细胞内注入0.25-0.5nl溶液；

6）在温控显微镜平台上使用较低强度的光和CCD摄像机观察细胞。

图3：AMCA标记的微管蛋白形成的微管

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02使用荧光探针（以Cat. # CY-SC203https://www.univ-bio.com/search.html?keyword=CY-SC203，SPY555-Tubulin Probe为例）进行微管蛋白染色步骤

1) 准备1000x储备液：向SPY555-Tubulin小瓶中加入50 µL无水DMSO，以制备1000倍储存液。建议使用新开封或新鲜的无水DMSO来制备此储存液，另外，不建议分装成小份（会造成化合物降解更快），另外该化合物不受多次冻融循环的影响；

2) 制备染色液：将SPY555-Tubulin稀释至1x于常用的细胞培养基中（例如含有10%胎牛血清的DMEM），并短暂涡旋混匀。如果稀释不是一步完成，请使用DMSO来制备中间稀释液，因为使用水性缓冲液会导致探针聚集；

3) 准备细胞及染色：当细胞达到所需的密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被覆盖，将细胞置于37°C、5%CO2的培养箱中，确定标记时间与探针浓度。

图3：Hela细胞使用SPY555-Tubulin染色的标记时间及探针使用浓度（不同细胞系可能会有所不同）

4）细胞成像：使用标准TMR或Cy3滤光片设置进行成像。染色完成后，可以直接对活细胞进行成像，无需清洗步骤。可选地，可以通过更换一次不含探针的新鲜培养基来简单清洗细胞，从而提高信噪比。如果需进行延时成像，建议在整个实验过程中保持探针在成像介质中，以获得稳定的信号。

图4：使用共焦显微镜与STED显微镜成像的SPY标记HeLa细胞比较。使用93X物镜成像，由Spirochrome公司提供。

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