解析环境因素帕金森病理中突触核蛋白累积与坏死性凋亡的关系

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种常见的神经退行性疾病[1]，尽管其病因至今尚不清楚，但一般认为与遗传、环境及其相互作用有关[2]。最近一项实证分析发现，随着社会中国民总收入增长越快，帕金森病的发病率上升也越快[3]，这加剧了认识环境污染对神经系统退行性危害的紧迫性。迄今为止，多种环境毒素包括多氯联苯磷酸盐（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）[4]鱼藤酮（rotenone）、百草枯（paraquat）、马尼布（maneb）[5]和溶剂三氯乙烯（trichloroethylene, TCE）[6，7]等被报道在人类接触后可诱发帕金森病样综合征。二硫化碳（Carbon disulfide, CS₂）具有广泛的中枢神经系统毒性，病例报告和横断面研究发现，接触 CS₂ 数十年后的粘胶人造丝制造工人患帕金森病的几率增加[8-10]。然而目前为止，包括CS₂ 在内的环境因素暴露与帕金森之间的分子机制仍不清楚。

该研究基于大鼠亚慢性染毒模型及SH-SY5Y细胞，揭示了CS₂暴露介导α-突触核蛋白（α-Synuclein）在黑质（Substantia nigra compacta, SNpc）多巴胺能神经元聚集并通过与坏死复合体（Necrosome）的相互作用诱发多巴胺能神经元坏死性凋亡（Necroptosis）和动物帕金森病样行为。

图1 CS₂诱导α-synuclein在大鼠多巴胺能神经元积累并通过与Necrosome作用激活坏死性凋亡信号通路

为了研究CS₂暴露大鼠的行为和病理表现，雄性Wistar大鼠根据CS₂暴露剂量被分为0g/kg体重对照组和0.3g/kg，0.6g/kg体重暴露组（图2A）。为了评估CS₂暴露后的运动障碍，每周进行一次行为实验，共进行了8周（图2B和2C）。研究发现，与对照组相比，CS₂暴露组大鼠的体重增长和转体跌倒潜伏期明显降低。CS₂暴露组大鼠的步态评分也明显高于对照组。0.3g/kg和0.6g/kg组大鼠的静止性震颤分别在第4周和第3周首次出现，第8周的发生率分别增至12.5%和75.0%。这些结果表明，接触 CS₂ 会诱发运动功能障碍。鉴于此，研究人员对暴露于 CS₂后 SNpc 中的多巴胺能神经元是否受损进行了研究。研究人员首先使用特异性酪氨酸羟化酶（TH）抗体检测了冰冻切片中的多巴胺能神经元，TH是一种多巴胺限速酶（图2D）。TH 阳性染色的定量表明 SNpc 中的多巴胺能神经元处于活跃状态。研究人员发现与对照组相比，CS₂暴露大鼠的 TH 染色显著减少（图2E）。这些结果表明，CS₂暴露降低了SNpc中多巴胺能神经元的活性。

图2 CS₂暴露致SNpc中多巴胺能神经元活性损伤。

上文证实了CS₂暴露对多巴胺能神经元的损伤，研究人员进一步探讨了细胞丢失的机制。为此，研究人员首先检测了中脑的坏死性凋亡信号传导（图3A），与对照组相比，CS₂暴露组的RIP1、p-RIP1、RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL的蛋白水平均显著升高（图3B）。同时，研究人员用抗p-MLKL和抗TH抗体标记了p-MLKL和TH，用冰冻切片检测了SNpc中多巴胺能神经元的坏死性凋亡情况（图3C）。与对照组相比，CS₂ 暴露组的多巴胺能神经元发生坏死性凋亡的细胞比例明显增加（图3D 和3E）。这表明CS₂暴露后多巴胺能神经元的坏死性凋亡。

图3 CS2暴露致SNpc中多巴胺能神经元发生坏死性凋亡。

由于α-synuclein被认为与帕金森病中多巴胺能神经元损伤密切相关，研究人员研究了CS₂是否会影响多巴胺能神经元中α-synuclein和磷酸化α-synuclein的积累。为此，研究人员首先测定了中脑中α-synuclein和p-α-synuclein的蛋白表达量（图4A），与对照组相比，暴露于CS₂的大鼠中α-synuclein和p-α-synuclein的蛋白水平显著增加（图4B）。接下来，研究人员进一步检测了冰冻切片中p-α-synuclein 的表达（图 4C）。与对照组相比，p-α-synuclein和 TH 共染的定量结果显示，暴露于 CS₂的大鼠多巴胺能神经元内的α-synuclein磷酸化显著增加（图4D和4E）。这些数据表明，暴露于CS₂ 会增强大鼠体内α-synuclein的异常积累和α-synuclein磷酸化。

图4 CS2暴露致多巴胺能神经元中α-synuclein的异常积累和α-synuclein磷酸化。

根据上述结果，α-synuclein聚集和坏死性凋亡信号激活同时发生，研究人员推测CS₂诱导的多巴胺神经元损伤可能是通过影响α-synuclein聚集引起的，而α-synuclein可能直接激活坏死性凋亡信号。为了证实这个观点，研究人员首先通过共免疫沉淀法检测了暴露大鼠中脑中的α-synuclein是否与坏死性凋亡信号相关蛋白相互作用（图5A）。研究人员发现α-synuclein可直接与RIP1、RIP3和MLKL相互作用，且在暴露于CS₂后其程度显著增加。此外，大鼠和 SH-SY5Y 细胞中的这些相互作用与CS₂ 暴露有关（图5B和5C）。这些结果表明，α-synuclein能与Necrosome相互作用，而CS₂暴露能促进这种相互作用。接下来，研究人员从蛋白质数据库（PDB）中获得了三种不同形式的α-synuclein（6i42，3q25，1xq8），以及包括RIP1（4itj）、RIP3（7mx3）、MLKL（4mwi）和RIP3-MLKL复合物（7mon）在内的Necrosome蛋白，并在PDBePISA中进行了计算分析。结果显示，α-synuclein与RIP3和RIP3-MLKL复合物蛋白有很强的相互作用（图5D和5E）。这些结果确立了α-synuclein与Necrosome之间的紧密联系。

图5 α-synuclein与Necrosome复合物有强的蛋白相互作用

文章结论与讨论，启发与展望

在这项研究中，CS₂暴露可诱导α-synuclein在大鼠黑质多巴胺能神经元中异常积累，通过与Necrosome作用引起神经元发生坏死性凋亡，最终导致大鼠出现类似帕金森氏症的行为。这项研究揭示了坏死性凋亡信号通路激活与α-synuclein失调之间的潜在相互作用，为帕金森病的发生提供了启示。当然，这项研究的动物实验是在雄性大鼠上进行的，性别和物种因素可能会对现有结论在推广到人体时产生未知的影响。通过SH-SY5Y 细胞系进行的细胞干预实验也可能无法完全模拟人类神经系统的复杂性。对α-synuclein与Necrosome作用关系的进一步研究可能有助于开发有效的治疗方法和策略，以预防或延缓这些使人衰弱的病症的发生。