揭示肾脏纤维化的新机制：细胞外微环境氧化应激驱动成纤维细胞活化和肾纤维化

肾脏纤维化以细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）过度积聚为特征，是多种慢性肾脏疾病（Chronic kidney disease，CKD）的常见结果。研究表明，纤维化病灶通常不均匀地分布在整个肾实质中，提示局部组织微环境在肾纤维化的发生和发展中起着关键作用。肾脏损伤后，在某些局部部位形成“纤维化生态位”（fibrogenic niche），从而提供一个促进成纤维细胞活化的特殊组织微环境[1，2]。虽然一系列细胞事件可能发生在纤维化生态位，但成纤维细胞活化是其中最主要的细胞事件，因为它使静止的成纤维细胞增殖，通过表达α-平滑肌肌动蛋白（Alpha smooth muscle Actin, α-SMA）获得肌成纤维细胞表型，并成为主要的基质生成细胞[3]。肾脏纤维化还与氧化应激有关，氧化应激是由活性氧（Reactive oxygen species，ROS）产生与抗氧化防御之间的不平衡引起的。然而，氧化应激如何与纤维化肾脏中的成纤维细胞活化相关联仍有待阐明。

提出一种崭新的机制，即抗氧化剂GPX3耗竭引起的细胞外微环境氧化应激是肾脏纤维化生态位的一个组成部分，诱导成纤维细胞活化和肾脏纤维化。

首先，研究团队通过无偏差RNA-seq方法鉴定了对照组和纤维化肾脏组中差异表达的基因，发现GPX（Glutathione peroxidase）抗氧化酶家族（GPX1-8）的mRNA表达发生了变化。在GPX1-8的八个亚型中，与对照组相比，GPX3 的mRNA水平明显下调。其次，对差异表达的基因进行了基因集富集分析，发现缺氧途径在纤维化肾脏中富集。这些结果表明，氧化应激可能在肾脏纤维化中发挥重要作用。Western Blot和免疫组化实验进一步表明，GPX3在正常对照小鼠的肾小管中大量表达，但在三种CKD（单侧缺血再灌注、单侧输尿管梗阻和5/6肾切除）模型小鼠的肾脏中其表达明显下调。同时，GPX3 的下调与 NOX4 （Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAPDH) oxidase-4）的上调有关。

研究团队随后探讨了GPX3 如何影响成纤维细胞的激活，通过转染特异的GPX3小干扰RNA（siRNA）从人肾近端肾小管细胞（HK-2）制备了GPX3耗竭的无细胞ECM支架。当将正常大鼠肾间质成纤维细胞（Normal rat kidney interstitial fibroblast cells, NRK-49F）细胞接种在GPX3耗竭的ECM支架上时，细胞上清中的ROS水平与对照组相比明显升高，且NOX4的mRNA和蛋白表达也被显著诱导。此外，GPX3耗竭的ECM支架促进了成纤维细胞中增殖相关的PCNA，Cyclin D1蛋白的表达，诱导纤维化指标FN和α-SMA的表达，以及p-p38的表达。这些结果表明，GPX3耗竭的细胞外微环境可导致ROS积累和NOX4上调，并自发诱导成纤维细胞增殖和活化。

研究团队进一步探讨GPX3耗竭导致成纤维细胞活化的机制，利用AOPPs（Advanced oxidation protein products）处理NRK-49F细胞和原代成纤维细胞来模拟GPX3丢失造成的氧化应激损伤。研究结果表明，AOPPs激活NOX4诱导肾成纤维细胞增殖与活化，并在体外激活PKCα/MAPK/STAT3信号级联反应。为了确认NOX4在介导AOPPs触发的成纤维细胞活化中的作用，研究人员在体外实验中使用NOX4-siR来敲低NOX4的表达，结果表明，敲低NOX4通过抑制 PKCα/MAPK 信号传导，并抑制成纤维细胞增殖与活化。

为了验证NOX4在体内肾损伤和纤维化中的作用，研究团队在体内通过使用短发夹RNA（shRNA）介导的NOX4-shR方法在单侧缺血再灌注损伤小鼠模型中敲除NOX4进行了深入研究，并将成纤维细胞接种在不同组小鼠来源的KTS上培养。结果发现，敲低NOX4可改善体内肾损伤和纤维化，并通过改善细胞外微环境氧化应激抑制体内成纤维细胞活化和增殖。

模式图：GPX3耗竭引起的细胞外微环境氧化应激促进成纤维细胞NOX4/ROS/PKCα/MAPK/STAT3信号转导激活，诱导成纤维细胞活化和增殖，促进肾脏纤维化。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该项研究通过使用转录组学分析和脱细胞ECM支架的方法，结合体外与体内实验，证明 GPX3 耗竭的细胞外微环境氧化应激是驱动成纤维细胞增殖和活化的纤维化生态位一个重要组成部分。GPX3的缺失会产生细胞外微环境氧化应激，通过NOX4/ROS/PKCα/MAPK/STAT3信号传导促进间质成纤维细胞的激活与增殖，并进一步诱导NOX4的表达，促进肾脏纤维化。

尽管已知氧化应激在CKD发展中发挥重要作用，但以往的研究主要集中在细胞内的信号传导。而该研究首次证明GPX3耗竭引起的细胞外微环境氧化应激如何驱动成纤维细胞活化和肾纤维化。因此，针对这种氧化应激微环境的策略可能是防治慢性肾脏纤维化的新方法。