基因组步移（Genome-walking）是一种获取未知侧翼DNA的技术，已成为分子生物学及相关领域不可或缺的一部分[1,2]。最早的步移技术基于繁琐的基因组文库构建与筛选；随后逐步发展出了简单、快速且可靠的PCR基方案[3,4]。PCR方法种类繁多，但依据原理总体上可以分为三类：（1）反向PCR；（2）连接介导的PCR；（3）随机引发PCR。前两类技术涉及限制酶切割和连接步骤。随机引发PCR则无需在扩增前对模板进行任何处理，但其步移效率和非特异性背景仍有待改进[5-8]。该方案设计了三条步移引物即腕表引物（Wristwatch primer，WWP），其3’端的12 bp和5’端的3 bp序列一致，而中间10 bp则两两之间完全错配。因此，仅在温度足够低的情况下，一条WWP才能退火至另一WWP的互补序列，并形成一种能选择性地富集侧翼序列的腕表样结构。该方法因此被称为腕表PCR（Wristwatch PCR）。通过调取微生物和水稻已知基因的侧翼序列，验证了方法的可行性。腕表PCR可成为现有基因组步移技术的替代方案。

该研究设计了一套共3条WWP，其特征是每两条WWP之间具有相同的5’端（12bp）和3’端（3bp），以及错配的中心区域（10bp）（表1）。任意两条WWP只能在低温退火，并形成腕表样结构。三条WWP因使用顺序不同，可形成三组不同的引物组合（表2）。在每次步移实验中，三个WWP组合分别与一套巢式特异性引物配对，平行进行三组WW-PCR扩增。每组WW-PCR包括三轮（一级、二级、三级）巢式扩增，分别由该WWP组合顺序配对巢式特异性引物进行。

表1本研究使用的腕表引物

（表源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

注：WWP是指Wristwatch primer即腕表引物

表2 腕表引物组合及其与特异性引物组的配对

（表源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

注：WWP是指Wristwatch primer即腕表引物；GSP是指gene-specific primer即基因特异性引物

每轮WWP-PCR执行一个低严谨型循环，以促使WWP在基因组模板上任意退火，或定向退火至前一轮扩增子的WWP位点，从而合成一个单链DNA（ssDNA）池。其中，目标ssDNA的3′末端为特异性引物（GSP）的互补序列，5’末端为WWP序列；在随后的一个高温循环中，GSP退火至其位于3′末端的互补区，延伸得到一条两端分别为完整的GSP和WWP的双链；在剩余的高温循环中，该双链呈指数扩增。非目标ssDNA因不存在任何引物的完整退火位点而不能被扩增。经过三轮巢式PCR，可有效地富集目标产物，同时消除非特异性背景。WWP-PCR的原理和实验步骤如下（图1，2）,一般仅需两轮PCR，即可得到目的条带。该方法完全基于PCR扩增，且WWP对任何基因组通用。

图1 腕表PCR原理图

（图源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

图2 腕表PCR方案流程图

（图源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

为了验证WW-PCR的可行性，用其分离短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因和水稻潮霉素的侧翼序列。结果表明，每个WW-PCR获得的清晰条带均为目标产物，且每次可步移达4 kb，显示出方法的高特异性和高效率。一些WW-PCR产生了多条DNA带，这是由于初级WWP在低退火循环中部分退火到了未知区域上的多个位点。由于巢式GSP之间的位置关系，二级扩增产物略大于三级产物（图3）。

图3 腕表PCR基因组步移验证结果

（图源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）