至今已有约55种核糖开关被研究报道。作为天然存在的顺式调控元件，核糖开关仅通过感知小分子配体的浓度变化便能实现对基因的表达调控，是细菌很多重要分子的感受器。它的这种简单、准确、高效的作用机制以及易于操作和改造的特点使核糖开关成为研究者们十分青睐的分子工具，可广泛应用于合成生物学等相关领域。因此，发现新的有价值的核糖开关并阐明它们与配体识别的结构基础，不仅有助于从原子水平理解其作用机制，还能为发现新型核糖开关及合成生物学的相关应用提供重要的指导意义。

长期专注核糖开关、核酶及各类核酸适配体的结构功能机制研究，至今已阐明包括II型胍核糖开关[1-2]、III型胍核糖开关[3]、V型S‐腺苷甲硫胺酸核糖开关[4]、古菌L7Ae类核糖开关[5]、II型谷氨酰胺核糖开关[6]、SAM-SAH核糖开关[7]、NAD⁺-I核糖开关[8]及MTR1甲基转移核酶[9]等的作用机制。本工作解析了3种不同序列以及3种不同配体共5种晶体结构，都同时观察到NAD⁺-II核糖开关含有两个不同的配体结合位点。

辅酶Ⅰ（NAD⁺）是生物体必需的一种辅酶，在生物氧化过程中起着传递氢的作用，能活化多种酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢（图1A）。2017年Breaker实验室在对大量微生物的基因间序列进行序列比对分析时，发现了第一类识别NAD⁺的核糖开关（NAD⁺-I核糖开关）。2020年黄林团队首次解析了NAD⁺-I核糖开关Domain1与NAD⁺结合的晶体结构，阐明了该核糖开关识别NAD⁺的部分机制[8]。

2021年，Breaker实验室利用序列比对分析发现一段位于pnuC基因上游的结构性RNA，并命名为pnuC motif[10]。后续实验表明pnuC motif极有可能是第二类识别NAD⁺的核糖开关，即NAD⁺-II核糖开关。进一步生化实验表明，NAD⁺-II核糖开关似乎只识别NAD⁺的NMN部分。

为了揭示NAD⁺-II核糖开关识别NAD⁺的精细三维结构和识别配体的分子机制，黄林课题组利用X-射线晶体学成功解析了3种不同序列以及3种不同配体组合的5个复合物晶体结构，最高分辨率达1.67Å。这些晶体结构整体构象比较接近，各结构之间的RMSD均小于0.6 Å。

整体上看，NAD⁺-II核糖开关包括P1茎、P1a茎、假结茎（PK）及茎与茎之间的连接区。P1茎和P1a茎在空间上形成连续堆积的主螺旋，P1a茎与该主螺旋垂直并向外延伸，且PK茎的部分碱基为核糖体结合位点（RBS）。此外，P1茎与靠近3’端的5个连续腺嘌呤形成了三螺旋结构，在P1茎的尾端还形成了两层四碱基平面（图1B, C）。对配体结合口袋分析可知，与NAD⁺-I核糖开关仅识别NAD⁺的ADP部分不同，NAD⁺-II核糖开关主要识别NAD⁺的NMN部分，且每个NAD⁺-II核糖开关分子有两个配体识别位点，形成两个空间位置完全不同的结合口袋（图1D）。在结合NMN时，1号结合位点（site 1）的NMN与G33:C46共平面，夹在G6:C32:A47:U7四碱基平面与C5:G34:A45三碱基平面之间，与C5、G33、C46之间均有氢键相互作用（图1E）。2号结合位点（site 2）在PK螺旋主槽内，NMN与C13:G52碱基对共平面，并与G52、A53、C10、G9形成氢键相互作用（图1F）。在结合NAD⁺时，NAD⁺-II核糖开关结合NAD⁺的NMN部分的方式与直接结合NMN小分子时一致但ADP部分的结合方式有所不同。1号结合位点中，NAD⁺的腺嘌呤部分位于P1a螺旋末端的结合口袋内。腺嘌呤和A18形成了一个堆叠在P1a螺旋末端的反式Hoogsteen-Watson-Crick碱基对，且该腺嘌呤碱基的N6与A18的N1形成氢键。而在2号结合位点，NAD⁺的腺嘌呤部分似乎不与RNA相互作用。此外，课题组还通过温控Native Gel验证了这两个结合位点都能稳定NAD⁺-II核糖开关的翻译关闭状态。

图1 NAD+-II核糖开关结合配体的三维结构

（图源：Peng, X. et al., Nucleic acids research, 2023）