从低级生物病毒到高等生物人类，蛋白质的结构和功能都受到蛋白翻译后修饰（Post TranslationalModification，PTM）的密切调控[1-4]。蛋白翻译后修饰也是影响Covid-19大流行的关键因素之一[5-7]。探索spike蛋白的PTM图谱，并发掘其对三维结构及其与ACE2等宿主因子结合能力的影响，可为预防和治疗新冠提供更有效的科学见解。目前的蛋白质结构表征方法，如冷冻电镜，由于不同的物理化学条件，难以准确捕捉到动态的、多种PTMs对spike蛋白结构的影响；而深度学习方法完全依赖于一级氨基酸序列，忽略了PTM对蛋白质结构形成的影响。因此，为了预测蛋白翻译后修饰对spike蛋白结构和功能的影响，必须克服以上两个难点，建立PTMs对蛋白结构影响的预测方法。该研究基于蛋白质组学技术，绘制了全面的SARS-CoV-2 spike蛋白的高分辨率定量PTM图谱；同时基于诱变原理模拟PTM的物理化学特征，提出了一种预测spike蛋白翻译后修饰对蛋白结构影响的计算方法；并进一步评估了spike蛋白高度修饰的RBD区域及与受体蛋白ACE2的相互作用，以揭示其结合强度。本工作为研究翻译后修饰对spike蛋白三维结构的影响奠定了基础，为设计更有效的新冠治疗方法提供了科学见解。

为阐明PTM在SARS-CoV-2 spike蛋白的结构和毒力中的作用，研究首先基于LC-MS/MS技术绘制了spike蛋白PTM的高分辨率图谱。其次，基于诱变的方法，以一种氨基酸取代翻译后修饰的氨基酸，以模拟交替的物理化学特征，重建了由PTM引起的spike蛋白结构异质性。最后，研究评估了spike蛋白高度修饰的RBD区域及其与受体蛋白ACE2的相互作用，以揭示其结合强度。该研究为spike蛋白结构分析和设计更有效的新冠治疗方法提供了新的科学见解。研究工作流程如图1所示。

图1 SARS-CoV-2 spike蛋白PTM图谱构建和结构预测流程图

（图源：Liang BW et al.,Research, 2023）

该研究首次利用LC-MS/MS数据绘制了全面的SARS-CoV-2 spike的高分辨率定量PTM图谱，以阐明全面的PTM位点，发掘出包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和糖基化等共计87个PTM位点。其中，在RBD区域确定了14个PTM位点（图2a, b）。同时，研究表明，PTM的发生频率对于理解其作用机制至关重要，尽管大多数PTM位点（67个）被单一类型的PTM修饰（糖基化），但其余的PTM位点（20个），如378K，被乙酰化修饰。以上结果表明，对PTM的全面表征可以呈现spike蛋白的翻译后修饰特征，进而有利于深入了解病毒的毒力和感染性的机制。

图2 SARS-CoV-2 Spike蛋白5个主要修饰位点的87个PTM位点分布

（图源：Liang BW et al.,Research, 2023）

研究进一步基于诱变的方法，以一种氨基酸取代PTM修饰的氨基酸，从而模拟替代修饰所带来的物理化学的变化。并根据替换后的序列预测spike蛋白的结构，重建了由PTM引起的spike蛋白结构异质性。为评估和验证该方法的准确性，研究者将预测的结构与冷冻电镜的实验所得到的结构进行比对，以比较结果的相似性和差异。同时，为分析不同的PTM对spike蛋白结构的影响，研究者通过单一氨基酸诱变来评估具体PTM修饰类型的影响，并发现甲基化和乙酰化对spike蛋白结构影响最为深刻（图3）。

最后，为评估因PTM修饰导致的spike蛋白功能的变化，研究者系统地计算了spike蛋白和宿主因子（ACE2，ASGR1和KREMEN1）复合物残基的极性、极性和带电特性，进而分析其结合的相互作用。研究结果表明，PTM导致spike蛋白与宿主因子的相互作用位点发生深刻的变化，其中甲基化修饰的spike蛋白与ACE2宿主因子的结合力最高。该结果可对因PTM影响的蛋白质结构和功能提供启示，并有助于药物发现、抗体设计和SARS-CoV-2感染的有效治疗（图4）。

图4 翻译后修饰的spike蛋白与ACE2的结合力和相互作用位点。

（图源：Liang BW et al., Research, 2023）