关注过生工生物公众号前几期关于实验室耗材理化、生物洁净性能的讨论文章的朋友们，可能会考虑到，除了金属元素低析出、常见的无菌无热原的需求，在做分子实验时，更需要考虑到所用耗材的无核酸酶洁净属性，包括无DNA酶、RNA酶，以免造成核酸样品的分解，影响实验结果。

有的时候，我们干脆会直接进一步考虑，从应用端效果要求，需要实验室耗材无PCR抑制，即对PCR实验不造成干扰产生抑制。

PCR实验反应涉及的因素和操作很多，产生被抑制时要考虑的原因也很多。大的层面可以分为两方面，一为PCR体系本身的因素，一为外部进入到体系的物质造成影响。

PCR体系因素

• 引物、探针。引物、探针的设计需要考虑特异性、长度、扩增跨度、碱基、修饰等原则，直接影响到整个PCR的扩增的引导和检测。

• 酶。酶的性能影响扩增效果和效率，酶的浓度也需要摸索合适的条件，若过低则可能降低扩增产物的量，若过高又可能引起非特异性扩增。

• dNTP。dNTP需要留意配制溶液的酸碱度，而且一般情况反应中的几种dNTP浓度也应一致，以免引起浓度过高的发生错配，同时也应避免过低影响产量。

• 模板。需要保证模板核酸的纯度、总量，避免降解。

• Mg²⁺。需注意镁离子的浓度，过高时会导致反应特异性降低，出现非特异性扩增，过低时会降低Taq 酶的活性，降低产量。

• 温度与时间。变性、退火、延伸的温度及时间，也需摸索合适条件，实验才能正常持续反应。

• 循环数。循环次数主要取决于模板的浓度，也需控制在适当范围内，过少则会导致扩增反应不足，过多则会引起非特异性产物增多。

体系外部因素 

体系外部的因素，又可以分为两大方面，内源性的物质和外源性的物质。

内源性的物质主要是样品自身组成成分，如免疫球蛋白、蛋白酶、血红蛋白、脂类、黏蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。欲避免这些因素，则要在样品纯化的阶段处理好这些物质。

外源性的物质主要是一些其他的抑制性物质，如肝素抗凝剂、纤维素、硝酸纤维素等，紫外线过度照射的矿物油或塑料析出，滑石粉，以及各种会接触到的实验室耗材如含有抑制物则也会造成影响。这些影响因素则是要在实验操作的过程中注意避免，同时也需选择无PCR抑制洁净属性的实验室耗材进行实验，或者验证使用的耗材是无PCR抑制的。

另外，一些PCR增强剂，如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等，虽然可对PCR反应产生增强效果，但是如果其浓度过高，也会相反对PCR产生抑制，因此需要注意使用浓度。

实验室耗材产生PCR抑制的可能因素也较多，例如：

有理论显示，环氧乙烷活性较高，两个碳原子均可以发生反应。

最常见的和DNA中的氮反生亲核开环反应，生成β-羟乙基衍生物。主要反应位点有：胞嘧啶N3、腺嘌呤N1和N3、鸟嘌呤N7、磷酸酯。

和磷酸酯的烷基化会导致DNA断裂。

因此，残留超标的环氧乙烷可能造成PCR反应体系中的DNA的减少，从而影响反应效果。

我们也经过实验看到，在qPCR实验中，Mix+酶的溶液中加入环氧乙烷之后，与对照组相比，反应的CT值增加较大，并且随着孵育时间的增加而增值变大。

那么，怎么去保证无PCR抑制的实验室耗材的产出呢？

首先，需要采用高品质的洁净塑料原材料，控制生产环境及人员操作的洁净标准，提高生产的自动化率以减少人为污染。

其次，产出品后续灭菌处理需遵循已验证标准。如是辐照灭菌处理，则选择耐辐照材料；如是紫外线灭菌需控制照度适量；如是环氧乙烷灭菌处理，则应保证自然解析时间，或者建立解析房进行处理，并通过解析时间的残留量的测试验证然后进行放行。

再者，加入产成品的无PCR抑制的质检项目，对耗材产品的无PCR抑制的洁净性能进行验证。选取检测样品的供试液，与对照样品同条件进行qPCR测试，需保证反应CT值不应超过规定值。

这样，则保证送到客户手中的耗材是不会对PCR实验产生影响的高品质实验室耗材。

BBI^@实验室耗材

生工生物的实验室耗材业务产线，遵循了上述原则，于10万级洁净车间内进行注塑生产，采用高洁净度的塑料原材料，配备自动化机械手臂，洁净规范操作，避免生产环境及过程或人为引入PCR抑制因素。并对产成品进行无PCR抑制检测验证，待检样品供试液与阴性对照品进行qPCR，满足CT值相差需在±0.5 Cycle之内，方可视为符合要求。以此确保我们生产的实验室耗材产品为无PCR抑制规格。