免疫疗法已被公认为癌症治疗的第五大支柱，它可以特异性靶向癌细胞，并通过免疫记忆实现长期应答，已经提高了多种血液肿瘤（非实体瘤）患者的生存率。然而，对于实体瘤患者来说，单一免疫疗法的疗效并不显著。由于“肿瘤-免疫循环”（Cancer-Immunity Cycle, CIC）的高度复杂性和异质性，导致其对免疫疗法的总体反应率有限。当免疫疗法被用于克服免疫功能障碍并促进CIC时，该过程的任何中断都可能导致治疗失败。因此，迫切需要开发精确的肿瘤建模方法。
在过去的十年中，体外三维模型作为先进的生物模型被开发出来，这使得人们可以深入了解细胞与细胞以及细胞与环境之间的相互作用。随着对癌症免疫治疗的关注，越来越多的工作开始使用三维模型来重建癌症中的局部或全身免疫环境。最近的进展表明了体外三维肿瘤免疫学模型具有潜在的实用性，包括在基础研究中更好地定义CIC，评估和探索免疫疗法，以及开发人工龛位辅助的“药物递送系统”（Drug Delivery System, DDS）。从而为在三维体外系统中解决实体瘤免疫治疗耐药或无效的问题提供了前所未有的机会，为进一步的理解细胞和分子机制、提高免疫治疗效果提供了多维的资源。
2023年7月4日，清华大学机械工程系生物制造团队孙伟教授/庞媛副研究员在Nature Reviews Immunology上在线发表了题为“Harnessing 3D in vitro systems to model immune responses to solid tumours: a step towards improving and creating personalized immunotherapies”的综述文章，清华大学机械工程系博士研究生周珍珍为该文章的第一作者，清华大学机械工程系生物制造团队庞媛副研究员和孙伟教授为本文的共同通讯作者。作者针对实体瘤现有免疫疗法的局限性，全面回顾了各种体外三维建模技术，并强调这些技术如何应用于模拟和再现CIC，以评估免疫治疗策略进而探索免疫治疗的优化方案及个性化的肿瘤免疫治疗。最后，针对该研究领域的挑战和重要发展机遇进行了评述和展望。
免疫疗法可以局部改变肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）或系统改善免疫监视，这些疗法明显推动了血液肿瘤的治疗。然而，大多数实体瘤患者无法从目前的免疫疗法中获益。CIC的巨大复杂性、异质性和适应性导致了对免疫疗法的不同反应。
免疫治疗抵抗或无效的机制可分为以下几类：首先，局部TME和全身免疫反应的免疫抑制环境可能导致驻留或浸润的细胞毒性免疫细胞失活或衰竭，如“细胞毒性T淋巴细胞”。其次，局部TME的变形结构和血管高渗渗漏对治疗性细胞浸润或药剂输送构成了物理屏障。三，由于TME和系统免疫反应的异质性，治疗性基因改造细胞上的特定分子结构总是导致反应的可变性和免疫抵抗。例如，实体瘤含有携带逃逸变体的细胞，可以逃避“嵌合抗原受体T细胞”（Chimeric Antigen Receptor T cell, CAR T cell）的定位。第四，有限的或不适当的给药方案导致疗效下降和副作用增加。然而，解决所有这些挑战是传统的肿瘤模型系统，即二维共培养和动物模型所不能及的。
由于材料科学、微加工、组织工程和三维打印技术的融合，现在可以设计生物三维模型。这些体外三维模型的出现为肿瘤免疫学和免疫疗法提供了全新的视角。因此，本文将回顾各种体外三维建模技术，包括支架、有机体、微流控和三维生物打印，并重点介绍如何利用这些技术来规划和组织CIC的复杂组件。
1. 基于支架的三维模型
在基于支架的三维模型中，细胞被植入到模拟实体组织的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的生物材料中（图1）。三维支架可通过自由堆叠不同形态的微颗粒或集成结构来建立。细胞接种是在微孔或纤维支架上进行的，支架的制备采用了不同的配制工艺（如两相乳化、发泡、冷冻干燥和静电纺丝）。支架平台可对递送的免疫调节剂和免疫细胞之间的相互作用进行时空调节，并重现免疫细胞的串扰。通过调整支架材料，研究ECM的物理和生物化学特性如何影响免疫治疗反应和免疫细胞功能。
图1. 用于肿瘤免疫学研究的基于支架的三维模型示意图
肿瘤类器官是自组织微型三维细胞聚集体，来源于原发肿瘤组织（或基因工程干细胞），能够保留亲代肿瘤组织的关键分子和结构特征（图2）。这些类器官模型补充了现有的确定癌症易感性和改善各种实体瘤类型治疗反应的方法。然而，以前的研究通常使用不含免疫细胞群的类器官模型，这些模型只能用于非免疫相关的肿瘤研究。最近，通过加入各种免疫细胞成分，类器官模型得到了进一步的发展和完善。它们被认为是人类癌症免疫生物学再现和免疫疗法测试的理想模型。
图2. 用于肿瘤免疫学研究的肿瘤类器官模型示意图
3. 微流体3D模型
尽管类器官模型可以通过简单的共培养或通过血管网络灌注将多种成分结合在一起，但包括细胞、基质和生化因子在内的各种成分的分布却无法在空间上确定。微流体三维模型结合了仿生生物学和微制造技术。通过允许空间调节的共培养、灌注流和信号梯度的空间控制，微流体技术已发展成为一种多功能工具，可进一步加强三维细胞培养的生理相关性。目前，常见的微流体三维模型构建方法包括三维水凝胶、液滴和柱状培养（图3）。
图3. 用于肿瘤免疫学研究的微流控三维模型示意图
4. 基于生物打印的三维模型
与在微流体芯片中预先确定的微框架内部署各种元件不同，生物打印可在完全开放的空间内自由有序地组装这些元件。生物打印通过将细胞或聚集体融入天然或合成ECM来构建人工组织（图4）。三维生物打印技术的优势在于可创建各种尺度的结构、有组织的组织拓扑和特定的组织构象。按照预定设计，癌细胞、基质细胞和免疫细胞以及物理和生化梯度在三维空间中一致排列，可系统研究TME中细胞与细胞之间以及细胞与ECM之间的相互作用。迄今为止，已开发出多种生物打印技术，包括挤压生物打印（Extrusion-based Bioprinting，EBB）、液滴生物打印（Droplet-based Bioprinting，DBB）、激光辅助生物打印（Laser-assisted Bioprinting，LAB）和吸气辅助生物打印（Aspiration-assisted Bioprinting，AAB），用于创建体外三维免疫肿瘤学模型。
图4. 用于肿瘤免疫学研究的基于生物打印的三维模型示意图
体外三维免疫肿瘤学模型的出现为深入研究细胞和分子机制、提高免疫治疗疗效提供了多维资源。然而，免疫肿瘤学模型现有的重要转化挑战包括实验时间短、标准化和高通量，这对建立这些模型的预测性临床严谨性至关重要。从人体或动物中提取的可高度模拟原始体内环境的脱细胞细胞外基质存在严重的批间差，是模型标准化的主要障碍。近年来，人们开发了具有特定配方的生物材料来提高可重复性，并向定向工程转变以实现CIC的重编程和免疫治疗。因此，基质环境正在成为癌症免疫学和免疫疗法的一个新的研究领域。最后，成功的构建体外三维免疫肿瘤学模型不仅有利于重塑传统的免疫肿瘤学研究方法，还有助于加速临床有效免疫疗法的转化，从而大大改善患者的肿瘤预后。
