发现过氧化氢酶有望成为诱导去势抵抗性前列腺癌发生铁死亡的新靶标

过氧化氢酶（catalase，CAT）是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一，在清除过氧化氢（H₂O₂）、从而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用。有研究显示，通过基因技术下调肿瘤细胞中CAT的表达，或用抗体与CAT结合抑制其活性，均能展现出良好的抗增殖效果。因此，抑制肿瘤细胞中CAT的活性有可能成为一种新的抗癌策略。然而，尽管CAT是最早发现的抗氧化酶，但到目前为止，具有抗肿瘤活性的CAT抑制剂报导极少，并且主要集中在溶液相互作用和调控胞内活性氧（ROS）水平的研究阶段。我们推测其可能的原因有两点，一是因为CAT的催化效率太高，而现有抑制剂的有效率偏低，很难在细胞内发挥足够的抑制活性；二是由于CAT的活性中心heme与酶的表面之间有一条狭长的通道，且活性空腔狭小，使得大部分化合物因位阻效应难以靠近heme[1]。因此采用传统的、靶向酶活性中心的抑制剂设计思路，不容易筛选出高抑制活性的CAT抑制剂。

铁死亡是一种新型的，不同于细胞凋亡、坏死和自噬的细胞程序性死亡方式，为铁依赖性脂质过氧化物（lipid peroxides，LPO）的积累所导致。因此，LPO的累积和铁代谢被认为是参与铁死亡的两个关键过程[2]。结合前段所述，胞内CAT活性被抑制时将使H₂O₂水平大幅提升，在Fe²⁺的催化下，Fenton反应加强，产生大量羟自由基（•OH），最终导致LPO的累积。由此提示，CAT有望作为诱导肿瘤细胞发生铁死亡的新靶标，而要实现这一目标的关键，在于设计合成出高活性的CAT抑制剂。

该研究成功设计并合成了一个高活性的CAT抑制剂——苯甲醛缩氨基硫脲类化合物BT-Br。在PBS溶液中，BT-Br对CAT的半抑制浓度（IC₅₀）为59.05 ± 5.32 nM。进一步的晶体结构分析结果显示，BT-Br结合在CAT的NADPH结合位点，这也是首个获得靶向该位点的CAT抑制剂的共晶结构。后续的细胞实验结果揭示，BT-Br在抑制去势抵抗性前列腺癌（CRPC）细胞DU145胞内的CAT活性的同时，可以诱导DU145 发生自噬，导致主要的铁存储蛋白（FTH1）发生降解，释放出Fe²⁺，进一步促进Fenton反应，从而诱导 DU145 细胞发生铁死亡。动物实验结果显示BT-Br可以有效抑制CRPC小鼠肿瘤的生长。这项研究表明，CAT有潜力成为基于铁死亡诱导策略治疗CRPC的新靶点。

该研究首先评估了BT-Br对DU145细胞中CAT的影响。结果表明，将不同浓度的BT-Br与DU145细胞共同孵育48h后，胞内ROS的浓度显著提升，且CAT mRNA的相对水平和蛋白含量均明显降低，表明BT-Br可以有效抑制DU145细胞中CAT的活性，并最终影响CAT的表达。接下来，为了更好地了解BT-Br与CAT的结合模式和结合位点，该研究通过质粒构建和蛋白表达纯化得到高纯度的人CAT，将其与BT-Br共结晶后，获得分辨率为2.2 Å的CAT-BT-Br共晶体（PDB ID:8HID）。晶体解析结果显示，BT-Br位于CAT的NADPH结合位点（图1左）。这是第一个结合在该位点，并表现出高抑制活性的小分子CAT抑制剂。

为了评估BT-Br对DU145细胞的影响，该研究将BT-Br分别与DU145细胞和正常前列腺细胞RWPE-1进行孵育，然后测试胞内ROS水平、LPO和细胞死亡率的变化。结果表明，当BT-Br浓度逐渐增大时，这三项铁死亡指标在DU145细胞中逐渐增强，而在RWPE-1细胞中变化均不大，表明BT-Br可选择性诱导DU145细胞发生铁死亡。此外，该研究将铁死亡抑制剂去铁胺（DFO）与BT-Br联用，作为BT-Br诱导铁死亡的表型挽救实验。结果显示，联用后DU145细胞中ROS水平、LPO水平以及细胞死亡率明显降低，证实了BT-Br的铁死亡诱导作用。

为进一步探究BT-Br诱导DU145细胞发生铁死亡的分子机制，该研究首先检测了BT-Br对铁死亡诱导的经典途径——谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4）的影响，结果表明，BT- Br既没有引起DU145细胞GSH的消耗，也没有抑制其GPx4的活性。而通过siRNA技术敲低DU145细胞中GPx4的表达，得到siGPx4 DU145细胞，与对照siNC DU145细胞相比，两种细胞的活力几乎相同，且BT-Br在两种细胞中的效应也几乎没有差异，表明DU145细胞不依赖GPx4清除胞内的LPO。这一现象在乳腺癌细胞MCF-7中也同样存在。

在排除经典的GPx4抑制途径后，该研究发现BT-Br作为CAT抑制剂在增加胞内ROS的同时，也增加DU145细胞中的LIP(labile iron pool，不稳定铁池)水平。而铁离子的增加极有可能是源于细胞含铁蛋白的降解，尤其是转铁蛋白受体1 (TfR1)或FTH1的降解[3]。于是该研究进一步检测BT-Br对DU145细胞中TfR1和FTH1表达的影响，Western blot分析结果显示，当添加BT-Br至2.5µM时，TfR1的含量几乎保持不变，而用0 ~ 1 µM不同浓度的 BT-Br处理DU145细胞时，FTH1 mRNA 和蛋白水平均明显下降。证实BT-Br诱导DU145细胞中的FTH1发生降解。

FTH1的降解被认为与细胞的自噬过程密不可分，而细胞自噬也在一定程度上促进细胞发生铁死亡[4]。为了确定BT-Br是否诱导了DU145细胞的自噬，本文将BT-Br与溶酶体抑制剂氯喹（CQ）或巴菲霉素A1（BafA1）联合使用，并检测DU145 胞内LIP和LPO水平的变化。结果表明，CQ和BafA1均可以阻断DU145细胞中BT-Br导致的LPO 和LIP的增加，说明BT-Br诱导DU145细胞发生自噬依赖性铁死亡。此外，本研究进一步通过透射电镜（TEM）检测DU145细胞与BT-Br作用后，细胞形态的变化以及自噬体的形成。与对照组相比，5.0 μM BT-Br与DU145细胞共同孵育4 h时，细胞图像呈现出线粒体体积缩小、双层膜密度增加等典型的铁死亡超微结构特征。当培养时间延长到12h后，这些特征变得更加明显。并且在孵育4h时，可以观察到DU145细胞内形成了明显的自噬体，从而证实了BT-Br诱导DU145细胞发生自噬的过程。

文献报道内质网应激可诱导细胞发生自噬[5]，为继续证实BT-Br诱导DU145细胞发生内质网应激，本研究检测了BT-Br对DU145细胞中两个内质网应激蛋白标志物——真核起始因子2a（eIF2a）和C/EBP同源蛋白（CHOP）的影响，并将BT-Br和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）联合处理DU145细胞。结果显示，随着BT-Br浓度的增加，eIF2a、磷酸化后的eIF2a（p-eIF2a）和CHOP的表达明显上调；而与1 mM 的4-PBA联用后，2.5 μM BT-Br诱导上调的eIF2a、p-eIF2a和CHOP的水平明显降低。结合上述结论，该研究阐明了BT-Br诱导DU145细胞产生内质网应激，引起细胞发生自噬，使得FTH1发生降解，导致LIP水平上升，从而促进Fenton反应，最终诱导DU145发生铁死亡的分子机制（图1右）。此外，该研究进一步通过动物实验评估BT-Br对人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤（DU145）的抑制效果，结果显示，当剂量为20 mg/kg (mpk)时，腹腔注射给药两周后，BT-Br对肿瘤体重的抑制率为58%，表明BT-Br可以有效抑制CRPC肿瘤的生长。

图1. （左）CAT-BT-Br的共晶结构（PDB ID:8HID）。（右）BT-Br诱导DU145细胞发生铁死亡的分子机制示意图。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究首次筛选出结合在CAT的NADPH结合位点的小分子抑制剂BT-Br，并探究其诱导CRPC DU145细胞发生铁死亡的效果和机制。该研究阐明，BT-Br一方面通过抑制CAT活性增加胞内ROS的水平，另一方面通过诱导DU145产生内质网应激并引起自噬，导致FTH1发生降解，从而提高胞内游离铁离子的浓度。基于此双重效应，BT-Br促进Fenton反应并产生高毒性产物•OH，诱导DU145细胞发生铁死亡，并最终有效抑制小鼠体内CRPC肿瘤的生长。虽然该论文在多个方面做出了突破性的探索，但仍然存在一些不足之处，基于NADPH为细胞内多个蛋白或者酶的辅因子，BT-Br如何在细胞内实现CAT的靶向性，并发挥其抑制效果，需进行更多的探讨。