骨肉瘤是一种好发于儿童和青少年人群的恶性骨肿瘤，5年生存率在25% - 30%之间[1]。手术和化疗是目前治疗骨肉瘤的主要手段，但化疗所带来的生存获益，近40余年来未再获得进一步的突破，因此，迫切需要开发新的骨肉瘤治疗策略[2]。光热疗法(photothermal therapy，PTT)是利用光热剂（photothermal agent，PTA），在近红外光（near-infrared，NIR）照射下，将光能转变为热能杀伤肿瘤细胞的一种无创性肿瘤治疗新方法，具有不良反应小、特异性高等优点[3]，然而，PTT对正常组织的热损伤一直是难以解决的问题，如何平衡杀伤效率和正常组织保护能力一直困扰着研究人员。除此之外，由于光的穿透深度有限，PTA在瘤内的积累和分布不足，使得PTT对深部实体瘤的治疗效果受到影响。目前，关于光热转换剂的研究众多，各种新型材料频出，影响PTA发挥作用的因素包括光吸收波长、尺寸大小及表面修饰等。尽管不同类型的PTA展现出了独特的优势，但一种集光热转换效率高、吸收波长长、生物安全性强、水溶性良好等众多优势为一体的光热材料有待被挖掘。
本研究通过受体工程，制备了一种供体-受体-受体（D–A–A'）结构的NIR-II aza-BODIPY基光热剂 (SW8)，用于1064 nm激光介导的骨肉瘤光热治疗（图1）。将供体基团变为受体基团，aza-BODIPYs的吸收最大值从NIR-I区(~808 nm)红移到了到NIR-II区(~1064 nm)。此外，SW8可以自组装成具有NIR-II强吸收和超高光热转化效率PCE（75％，1064 nm）的纳米颗粒(SW8@NPs)。这种超高PCE主要源自超快的分子间非辐射跃迁，是传统的分子内非辐射跃迁速率的大约100倍。最后，细胞和动物应用结果表明，在1064 nm激光介导下SW8@NPs可通过诱导细胞凋亡和焦亡的协同途径实现骨肉瘤的光热治疗，达到消融深部肿瘤且副作用小的目的。该研究不仅阐明了一种时空精准调控治疗深部肿瘤的方法，也为构建高性能小分子NIR-II光热剂提供了新的策略。
图1. 新型aza- BODIPY基NIR-II PTAs的理性设计及对骨肿瘤的光热治疗
本研究以aza-BODIPY为母体，设计合成了SW1-8系列有机小分子。光谱测试结果（图2b）显示从SW5到SW6的吸收光谱（黑色）和发射光谱（红色）发生了明显的红移，其中给电子的苯供体(D')变成了吡啶受体(A')。A′缺电子性增加导致SW6-8的吸收波长进一步红移，而供电子部分(SW1-5)未发生明显地波长红移。此外，烷基链的引入也增强了分子的J-聚集，导致SW6-8发射波长的红移。含时密度泛函理论（TD-DFT)计算显示，SW5到SW8的HOMO-LUMO能隙逐渐减小(图2c)，变化趋势与吸收光谱一致。这些结果表明，aza-BODIPY的3位和5位受体基团显著减小了分子的能隙，为构建新型有机小分子NIR-II材料提供了新思路。
图2. SW1-8的合成及其光物理性质
选取吸收/发射波长最具优势的SW8进行纳米化自组装(图3a)，将SW8封装到两亲性基质中形成水溶性纳米颗粒(SW8@NPs)。在1064 nm激光照射下，SW8@NPs的PCE高达75%(图3c)，与SW1-7@NPs相比显著提高(图3d)。飞秒瞬态吸收光谱研究表明(图3f)，SW8@NPs存在分子间非辐射衰减通道，其衰减速率高达1.3 × 1013 s-1，大约是传统分子内非辐射跃迁（如内转换）速率的100倍，这种超快的分子间非辐射跃迁是SW8@NPs具有超高PCE的主要原因。
图3. SW1-8@NPs的制备、表征和光物理性质
为了研究SW8@NPs的生物相容性，文中采用SW8@NPs处理骨肉瘤细胞143B，结果表明，SW8@NPs能被细胞高效摄取，且暗毒性低、光毒性高，808 nm和1064 nm激光照射后能诱导细胞凋亡水平显著增加。且与808 nm激光相比，1064 nm光源能穿透15 mm厚的的肌肉组织，有效激发SW8@NPs产热（图4a）。在小鼠143B原位骨肿瘤模型中进一步研究表明，SW8@NPs在肿瘤部位蓄积度高（图4b）、光热效应强（图4c）。SW8@NPs尾静脉注射骨肿瘤小鼠，每2天注射1次，并在注射后24 h分别采用808 nm (0.33 W cm-2)和1064 nm (0.5 W cm-2)激光照射肿瘤部位10 min，X-ray成像监测原位肿瘤生长情况，12天后切除肿瘤组织，称重并做组织病理学和分子生物学分析。结果显示，在1064 nm激光照射下，SW8@NPs处理可显著抑制肿瘤的生长至观察终点(图5e，f)。而对照组和SW8@NPs+808 nm照射组肿瘤生长迅速，至观察终点时肿瘤体积、重量比SW8@NPs+1064 nm组平均增加4-5倍(图5g和5h)。
图4. SW8@NPs在808/1064 nm激光照射下的体内光热效应及小鼠骨肿瘤的光热治疗
组织病理学结果显示，SW8@NPs+1064 nm组肿瘤组织结构破坏严重，肿瘤实质细胞大量消失，呈空泡状，且TUNEL结果显示组织细胞凋亡水平显著增高（图5a）。凋亡通路相关蛋白(Bax、Bcl2、Caspase 3、Caspase 9和PARP1)的免疫印迹分析表明，SW8@NPs+1064 nm组凋亡蛋白整体磷酸化表达水平增高，凋亡激活（图5b,c）。另一方面，焦亡通路蛋白Caspase 1和Gasdermin D的磷酸化水平在SW8@NPs+1064 nm照射下也显著上调（图5b,d）。以上结果揭示了在1064 nm 激光诱导下，SW8@NPs通过协同调控凋亡、焦亡机制发挥抗肿瘤作用。
图5. 808/1064 nm激光照射下SW8@NPs对肿瘤组织凋亡、焦亡通路的影响
综上所述，本研究设计合成了一种新型有机小分子光热剂SW8，自组装成纳米颗粒后在NIR-II窗口下PCE可达75%。分子激发态动力学分析揭示，非辐射衰变途径是其具有超高PCE的光物理机制。经体内外生物模型验证，SW8@NPs在1064 nm激光照射下以协同诱导细胞凋亡/焦亡的方式有效甚至完全控制骨肿瘤生长，且无明显副作用。SW8纳米粒子作为NIR-II窗口的有机小分子光热剂不仅能抑制深部肿瘤的原位生长，且热损伤小，生物安全性高，在肿瘤光热治疗的临床应用中展现出巨大潜力。
