基于HiBiT的PCSK9分泌检测：蛋白质转运研究的强大工具
本文展示了使用HiBiT标签技术研究PCSK9分泌方面的强大能力。HiBiT通过微孔板发光检测和印迹分析，为传统方法提供低背景、高定量的替代方案。此外，HiBiT还适用于研究GPCR转运、质膜转运等细胞外蛋白质动态，并可通过CRISPR技术在内源性水平研究蛋白质。HiBiT已逐渐成为研究蛋白质转运、分泌机制以及治疗性蛋白质生产的强大且多功能的工具。
关键词：蛋白定位，蛋白转运，蛋白定量，蛋白质分泌，PCSK9。
01关于HiBiT标签
● HiBiT是一种由11个氨基酸组成的肽标签，专为高灵敏度的生物发光检测和蛋白质定量而开发。
● HiBiT的小尺寸特性使其成为追踪蛋白质表达和定位的理想工具，因为它对被标记蛋白质的功能和结构干扰极小。
● HiBiT与其互补亚基LgBiT具有高亲和力结合，形成一种具有活性的发光酶。当加入生物发光底物时，这种相互作用会产生与HiBiT标记蛋白质的浓度直接相关的强效、可定量的发光信号，从而实现精确且实时的蛋白质分析。
● 与传统的免疫分析方法（如ELISA，只能在固定时间点捕获蛋白质水平）或Western blotting（需要蛋白质分离和转膜）相比，HiBiT能够以更高的灵敏度和更低的背景噪声实时追踪蛋白质动态。
由于LgBiT无法穿透细胞膜的特性，HiBiT是研究细胞外蛋白质活性（包括蛋白质分泌）的强大工具。在Nano-Glo® HiBiT细胞外检测系统中，LgBiT被添加到活细胞培养基中，仅与细胞外的HiBiT标记蛋白质结合，从而选择性地定量细胞外蛋白质群体。该系统可用于研究多种细胞外蛋白质活性，包括受体内化和再循环、蛋白质向细胞表面的转运以及蛋白质的细胞分泌过程。
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图1：展示Nano-Glo® HiBiT细胞外检测系统的工作流程
02使用HiBiT研究PCSK9分泌
01背景介绍
Promega科学家旨在展示HiBiT技术在研究细胞外蛋白质分泌方面的强大能力。作为模型系统，他们研究了前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型（PCSK9）的加工和分泌。PCSK9与脂质调节密切相关：其过度表达与高脂血症相关，而分泌减少或基因敲除则导致低脂血症（Abifadel等，2003；Cohen等，2006）。鉴于这种紧密关联，PCSK9已成为一个引人注目的治疗靶点，并推动了两种FDA批准的抗体疗法——Praluent（赛诺菲/再生元）和Repatha（安进）的开发。
先前的研究已经确定了PCSK9的分泌行为。在分泌之前，PCSK9在内质网中依赖其蛋白酶结构域进行自蛋白水解过程。PCSK9基因组的修饰（包括影响该自切割过程的基因修饰）会导致其分泌发生变化。其中之一是H226A突变，它阻断了自蛋白水解过程，导致蛋白质滞留在内质网中（Benjannet等，2004）。另一个是C679X突变，它导致PCSK9错误折叠，从而滞留在内质网中，但不抑制蛋白水解（Zhao等，2006）。
02基于HiBiT的PCSK9分泌检测
为了利用HiBiT评估这些突变对PCSK9分泌的影响，HEK293细胞被转染了C端HiBiT标记的PCSK9表达载体，载体包含野生型（WT）蛋白质序列或含H226A或C679X突变的蛋白编码序列。使用Nano-Glo® HiBiT细胞外检测系统对分泌的PCSK9进行定量（图2）。在获取细胞外蛋白的读数后，通过添加洋地黄皂苷裂解细胞以测量孔中的总PCSK9（包括细胞内蛋白质）。由于野生型PCSK9能够有效分泌，孔中几乎100%的总PCSK9都位于细胞外。然而，对于两种PCSK9突变，只有一小部分总PCSK9位于细胞外，而细胞裂解后信号显著增加。突变阻断有效分泌的能力显而易见，因为H226A突变体的分泌蛋白比例仅为0.25%，而C679X突变体为1%。这些结果证明了HiBiT能够灵敏地检测蛋白质转运的变化。
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图2. HiBiT发光检测量化了PCSK9突变对其细胞分泌的抑制作用。HiBiT标记的野生型（WT）PCSK9能够高效分泌，表现为细胞外HiBiT的高信号几乎占孔中总HiBiT的100%。H226A和C679X突变不仅显著降低了细胞外PCSK9-HiBiT的信号，而且通过洋地黄皂苷裂解细胞后信号增加了约100倍，表明孔中只有约1%的总PCSK9被分泌。
03HiBiT印迹分析
为了更详细地研究这些突变如何影响PCSK9的分泌，通过SDS-PAGE分离细胞提取物和细胞培养基中的蛋白质，并使用Nano-Glo® HiBiT印迹系统检测HiBiT标记的PCSK9（图3）。与传统的Western印迹分析不同，HiBiT印迹分析是一种无抗体系统，通过在膜上进行HiBiT-LgBiT互补形成发光的NanoBiT®酶。这种方法提供了比Western印迹分析更快、更简化的工作流程，同时通过酶互补的选择性显著提高了特异性和信号背景比。细胞裂解物的分离结果显示，细胞中的PCSK9以两种形式存在，即未加工的前体PCSK9形式和加工后的PCSK9形式（图3，泳道1）。前体PCSK9通过其枯草杆菌蛋白酶/kexin自水解活性进行自我切割，而较小的加工形式则被分泌并积累在细胞培养基中（图3，泳道4）。由于H226A突变阻断了蛋白水解活性，它仅以较大的未加工形式存在（图3，泳道2），且未检测到分泌（图3，泳道5）。另一方面，PCSK9 C679X突变仍具有自蛋白水解活性，在细胞提取物中可以检测到前体PCSK9和加工后的形式（图3，泳道3）。然而，未检测到分泌的蛋白质（图3，泳道6）。PCSK9 C679X突变截断了最后14个残基，导致错误折叠，从而阻断分泌但不影响蛋白水解加工（Horton等，2007）。
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图3. HiBiT印迹分析揭示了PCSK9突变对细胞内加工和分泌的不同影响。在细胞提取物中（泳道1-3），WT PCSK9以未加工（前体PCSK9）和加工后的形式存在。H226A突变阻止了蛋白水解加工（泳道2），而C679X突变允许加工（泳道3）。在细胞培养基中（泳道4-6），仅检测到加工后的WT PCSK9形式，证实两种突变均阻断了分泌。
04PCSK9分泌的时间动态测量
为了评估PCSK9分泌的动态变化，使用Nano-Glo® HiBiT细胞外检测系统在24小时内测量HiBiT发光。在未处理的细胞中，细胞外PCSK9水平随时间稳步增加，与活跃的分泌一致。相比之下，用分泌抑制剂布雷菲德菌素A（BFA）处理的细胞显示细胞外PCSK9没有增加，而总蛋白质水平以与未处理细胞几乎相同的速率增加。这些结果证实，观察到的细胞外信号反映了分泌，而不是蛋白质合成或细胞活力的差异，展示了HiBiT如何实现实时、定量追踪蛋白质分泌动力学。
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图4. PCSK9-HiBiT分泌的时程测量。在转染的HEK293细胞中，在24小时内测量细胞外PCSK9-HiBiT信号（红色方块）和裂解条件下的总PCSK9-HiBiT信号（蓝色三角形）。在用布雷菲德菌素A（BFA）处理的细胞中（实心符号），由于新蛋白质的合成，总PCSK9-HiBiT水平继续上升（实心蓝色三角形），但细胞外PCSK9-HiBiT保持不变（实心红色方块）。在未处理的细胞中（空心符号），细胞外和总PCSK9-HiBiT信号均随时间增加，表明新合成的蛋白质被高效分泌。
05结论
本研究展示了HiBiT如何以高灵敏度和精确度追踪蛋白质的表达、加工和分泌。通过基于HiBiT的检测，我们证实了野生型PCSK9能够高效分泌，而H226A和C679X突变通过不同的机制导致细胞内滞留。H226A突变阻止了自蛋白水解加工，导致内质网滞留，而C679X突变破坏了蛋白质的正确折叠，同样导致细胞内积累。这些结果验证了HiBiT作为一种强大工具，能够通过基于微孔板的发光检测和HiBiT印迹分析检测蛋白质转运的变化，为传统方法提供了一种低背景、高定量的替代方案。
除了PCSK9，HiBiT检测还广泛适用于研究细胞外蛋白质动态，包括监测GPCR转运，并促进蛋白质向质膜转运的测量。通过CRISPR介导的基因组编辑引入HiBiT的能力进一步扩展了其应用范围，使其能够在适当的调控下以内源性表达水平研究蛋白质。Promega提供多种预置HiBiT标签的CRISPR即用型报告细胞系。此外，通过将LgBiT蛋白质和稳定的底物直接添加到培养基中，可以进行实时动力学分泌测量，从而实现对分泌事件的连续发光追踪。
随着这些扩展应用，HiBiT成为研究蛋白质转运、分泌机制和治疗性蛋白质生产的强大且多功能的工具，适用于基础和应用研究。
06参考文献
1. Benjannet, S., et al (2004). NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: Zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry, 279(47), 48865–48875. https://doi.org/10.1074/jbc.M409699200
2. Horton, J.D., et al (2007). Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. In Trends in Biochemical Sciences (Vol. 32, Issue 2, pp. 71–77).
https://doi.org/10.1016/j.tibs.2006.12.008
3. Zhao, Z., et al (2006). ARTICLE Molecular Characterization of Loss-of-Function Mutations in PCSK9 and Identification of a Compound Heterozygote. In The American Journal of Human Genetics (Vol. 79).
产品订购：
| 产品 | 规格 | 目录号 |
| Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System（细胞外检测系统） | 10ml | N2420 |
| Nano-Glo® HiBiT Blotting System（印记系统 | 100ml | N2410 |
| GloMax® Discover发光检测仪 | 1 each | GM3000 |
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