肝性脑病（Hepatic encephalopathy，HE）是指急性或慢性肝功能衰竭或门静脉分流导致的脑功能紊乱。住院率的上升给医疗保健系统带来了沉重的负担。HE的早期症状之一是运动迟缓，其特征是运动活动缓慢和运动协调受损。研究HE运动迟缓的潜在机制具有重要意义。

 

越来越多的研究表明，氨可以诱导活性氧（ROS）的形成并增加氧化应激水平。研究发现，ROS可能引发一系列不良反应，特别是对线粒体形态和功能以及神经元活性的影响。值得注意的是，最近的临床报告已经证实，早期减少HE患者的氧化应激可以最大限度地减少严重神经毒性的发生。氧化应激在HE的发病机制中具有重要意义，但其潜在机制仍有待阐明。

 

运动活动由基底神经节-丘脑-皮层回路中的GABA和谷氨酸调节。γ-氨基丁酸（GABA）是主要的抑制性神经递质。GABA释放（GABA能）神经元在哺乳动物和人脑中作为中枢神经系统的抑制性神经元发挥着至关重要的作用。1982年，Schafer和Jones提出了“GABA能调”增加有助于HE发病机制的假说。从那时起，越来越多的证据表明，HE在大脑的各个部位诱导GABA水平的升高，包括小脑和海马。此外，研究表明，HE动物大脑中GABAA受体水平增加。《科学》杂志最近的一篇文章报道，SNr中谷氨酸脱羧酶2（GAD2）神经元的光遗传学激活导致运动终止的显著增强。然而，目前尚不清楚HE是否可以被自身或直接刺激GABA能神经元的局部高氨水平激活。此外，化学遗传学操作对HE的影响神经元尚未得到解决。HE的表现是多种致病因素的结果，包括大脑生物能量学、线粒体功能障碍、氧化应激和神经炎症。因此，探索HE的病理生理机制具有重要潜在意义。

 

 

 

一、TAA诱导小鼠的HE样症状和全身氧化应激

首先，将连续3天的150 mg/kg TAA注射用于研究。研究发现，TAA诱导了肝损伤，H&E染色显示肝细胞坏死（图1a），血ALT、AST和TBil水平升高（图1b–d），血氨（图1e），以及Elisa显示的脑氨（图1f）。此外，TAA诱导了全身氧化应激，表现为血液SOD和GPx水平显著降低（图1g，h），并受到抗氧化活性生物标志物的影响。通过转棒测试，TAA小鼠表现出平衡障碍（图1i和见下文），通过旷场测试，总距离和自发运动速度降低（图1j，k）。这些数据表明，TAA在小鼠中诱导了HE样症状和全身氧化应激。

 

图1.TAA处理的小鼠表现出HE相关的肝脏和行为变化

 

二、TAA诱导脑氧化应激，但SNr特异性线粒体功能障碍

SNr在介导HE的运动缺陷中起着关键作用。大脑皮层是另一个受到高氨血症和氧化应激攻击的靶点。考虑到这一点，检测了自噬标记物（LC3B和PINK1）、抗氧化应激标记物（SOD1和GPx1）、线粒体解偶联蛋白（UCP2、UCP4和UCP5）和线粒体因子的表达水平，包括动力蛋白相关蛋白1的线粒体前分裂因子（DRP1）及其磷酸化版本的p-DRP1，在SNr和大脑皮层中，负责中央分裂的线粒体分裂因子（MFF）、负责周边分裂的线粒体分裂蛋白1（FIS1）和线粒体融合蛋白2（MFN2））。蛋白质印迹结果所示，在SNr中，TAA诱导自噬、线粒体分裂以及氧化应激指标均明显增加。

 

图2. TAA诱导的SNr神经元遭受氧化应激和线粒体功能障碍

 

三、TAA激活内侧SNr表达GAD2的GABA群体

采用活性群体靶向重组（TRAP）方法选择对特定刺激激活的神经元的通路，以获得对HE诱导的神经元的遗传通路。在双侧SNr内注射pAAV-hSynDIO-mCherry病毒载体的FOS cre ERT2（TRAP2）小鼠用于靶向TRAPing至SNr区域，并将标记限制在神经元群体中。令人惊讶的是，mSNr观察到TAA-TRAPed细胞的急剧增加，而不是lSNr。此外，还分析了FOS+神经元最常表达的标志物类型。hSyn启动子的有效性在图中得到了证实。如图所示，90%的TRAPed细胞是GABA能（表达GAD1、GAD2或PV），其中大多数表达为GAD1或GAD2（81%），而不是PV（8%）。在此，TAA在mSNr处主要激活表达GAD2的GABA群体。

 

图3. TAA或直接局部高氨刺激激活SNr GABA神经元

 

四、化学遗传学抑制表达SNrGAD2的GABA群体改善HE

DREADD是一种基因修饰的毒蕈碱受体，对内源性乙酰胆碱没有亲和力，而受体可以被CNO（或DCZ）激活，CNO是非典型抗精神病药物氯氮平的一种药理学惰性代谢产物。DREADD可以通过Gq或Gi途径分别偶联以刺激或抑制神经元活动。使用两个配体（CNO和DCZ）来激活hM4D（Gi）受体和hM3D（Gq）受体，实验程序如图4a所示。。Gi或Gq病毒载体被注射用于化学遗传学操作。冠状切片上病毒载体的共焦照片证实了正确的立体定位（图4b）。膜片钳记录用于证明Gi组中表达红色mCherry的SNr神经元的电生理特征。结果证实了这些化学遗传学抑制的神经元的放电减少（图6c）。与CNO前组相比，CNO后组中表达GAD2的GABA群体的放电率急剧下降（图6d）。旷场试验的结果证实了Gi组的运动改善（图6e、f）。

 

图4. SNr^GAD2神经元活动对HE运动行为的影响

 

五、SNr^GAD2群体的UCP2-OE改善了TA诱导的HE

进一步，研究了UCP2通过调节氧化应激和线粒体动力学对SNrGAD2神经元HE行为的保护作用。作为一种线粒体蛋白，UCP2在线粒体功能中发挥着关键作用，包括将氧化磷酸化与ATP合成分离，并控制质子重新进入线粒体基质29。将UCP2病毒载体注射到GAD2 ires-cre小鼠的双侧SNr中，以选择性靶向表达GAD2的GABA群体（图5a段）。Ucp2-OE治疗减轻了TAA小鼠的运动迟缓，而Ucp2-KD治疗加重了运动迟缓（图5c，d）。研究表明，Ucp2-OE处理减轻了氧化应激（图5e，f）、自噬（图5g，h）和线粒体断裂（图5i，j）。相反，Ucp2-KD处理加重了氧化应激、自噬和线粒体断裂。这些结果表明，针对SNrGAD2群的Ucp2-OE改善了HE。

 

 

图5. UCP2对GAD2小鼠行为及神经元内线粒体的影响

 

图6. HE运动迟缓机制的模式图

 

文章结论与讨论，启发与展望

总之，该研究表明HE或局部高氨刺激可以直接激活内侧SNr区表达GAD2的GABA群体。此外，抑制该群体的化学遗传，或在该群体中靶向过表达线粒体UCP2，或系统性应用线粒体靶向抗氧化药物Mito-Q均可有效改善HE。该研究提示SNr^GAD2群体线粒体对氨失衡敏感，可作为HE治疗的中心。本研究为线粒体与HE的关系提供了一个新的视角。