分子技术：基因沉默搞不懂？不存在的事！
在生物科学领域，基因沉默现象引起了科研人员极大的兴趣。基因沉默，顾名思义，是指通过特定手段使基因失去活性或降低其表达水平的过程。这一现象在生物体内普遍存在，对于维持生命活动的稳定以及应对各种环境变化具有重要意义。本文将详细介绍基因沉默的概念、常用技术和实验步骤，展望其应用前景，以期帮助读者更好地理解这一现象。
基因沉默的概念
基因沉默主要指基因表达的抑制和沉默现象。在生物体内，基因的表达受到严格调控，而基因沉默就是一种重要的基因表达调控方式。根据作用方式的不同，基因沉默可分为自然发生的基因沉默和人为操作的基因沉默。自然发生的基因沉默可通过多种因素实现，如DNA甲基化、异染色质形成、转录后基因沉默（RNAi）等。而人为操作的基因沉默则可以通过基因敲除、转录因子抑制、表观遗传修饰等方法实现。
常用基因沉默技术
☆ RNA干扰（RNAi）：RNAi技术利用双链RNA（dsRNA）引发特异性mRNA的降解，从而降低或关闭目标基因的表达。RNAi技术具有高效、特异性强、操作简单等优点，已成为研究基因功能和药物筛选的重要工具。然而，该技术也存在一定的脱靶效应和细胞毒性等问题。
☆ 化学沉默：化学沉默是指通过特定的化学抑制剂或药物作用于细胞，干扰基因的表达或转录过程，从而实现基因沉默。常用的化学沉默药物包括DNA甲基化抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂等。这类方法的优点是可以通过口服或注射给药，直接作用于患者体液或组织，但对于作用机制和药物剂量要求较高。
☆ 基因敲除：基因敲除技术通过同源重组或CRISPR-Cas9等手段，将目标基因进行部分或完全敲除。该技术具有较高的特异性和可操作性，但需要设计特异性的核酸酶，且存在一定的细胞毒性风险。
RNA干扰（RNAi）基因沉默技术的基本步骤
☆ 寻找目的基因：确定想要沉默的目标基因，可以通过文献研究、基因表达谱分析等方法来筛选。
☆ 设计并合成siRNA：根据目标基因的序列，设计并合成能与目标基因特异结合的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）。shRNA在细胞内被转录和表达后，会形成约21-23bp的siRNA。
☆ 转录和表达shRNA：将设计好的shRNA通过转染或者其他方式转入到细胞中，并在细胞内转录和表达shRNA。
☆ siRNA与目标基因结合：转录后形成的siRNA在细胞内与目标基因结合，抑制目标基因的表达。这一过程需要RNA解旋酶将siRNA双链解开，反义链与RNA诱导沉默复合物RISC形成复合物，最终由siRNA互补结合靶RNA引导核酸酶切割，实现转录后水平的基因沉默。
☆ 验证基因沉默效果：通过qRT-PCR、Western Blot等技术检测目标基因的表达水平，评估基因沉默效果。
这些步骤是RNAi基因沉默技术的基本流程，具体操作可能因实验室和研究需求而有所不同。
PS：
shRNA和siRNA在RNAi过程中具有密切关系。它们都是具有一定结构特点的RNA序列，在RNAi通路中发挥关键作用。
siRNA是RNA干扰过程中触发基因沉默的主要分子。在RNAi通路中，siRNA通过与互补mRNA分子杂交干扰基因表达。这种干扰会导致mRNA降解，进而抑制特定基因的表达。
shRNA是siRNA的前体，由短发夹RNA（short hairpin RNA）加工而来。shRNA的结构由互补的两条序列及loop环组成。在形成siRNA的过程中，shRNA会被Dicer酶切割，生成21-23bp的siRNA。然后，siRNA会装载到RISC复合物上，并与与其序列同源的靶mRNA结合，引导RISC复合物切割靶mRNA，从而触发基因沉默。
总之，shRNA和siRNA在RNAi过程中具有密切关系，shRNA经过加工生成siRNA，后者是触发基因沉默的关键分子。
基因沉默RNAi试剂推荐
1. Dharmacon可提供的siRNA产品类型
1）ON-TARGETplus™ siRNA——全新的基因沉默标准，显著降低脱靶效应
基因沉默中最主要的脱靶效应是由反义链中“seed region”活性引起的，一味地提高反义链的活性可能增加由反义链引起的脱靶。ON-TARGETplus ™在SMARTselection技术基础上结合最新的功能性和特异性设计原则，并利用独—无二的双链修饰技术——结合正义链失活技术和反义链seed region 修饰技术，同时减少由双链引起的脱靶效应，使得ON-TARGETplus™ siRNA的脱靶效应降到最低。
图注：ON-TARGETplus™修饰减少了脱靶效应，而SMARTpool进一步减少了脱靶的数量
2）siGENOME™ siRNA——经济、可信的基因沉默工具
siGENOME™合理分析链偏好性，选择合适靶点，同时选择性使用ON-TARGET™技术保证沉默效率和低脱靶率。
3）Accell™ siRNA—史无前例的新武器，无需任何转染试剂
☆ 极简的操作方法：无需转染试剂、电转仪器或病毒载体即可完成高效siRNA投递
☆ 创新的siRNA修饰专利方法，同时拥有高摄取率、高稳定性、高特异性和高沉默效率
☆ 已在神经细胞、免疫细胞、原代细胞等难转染的细胞中成功应用
☆ 特殊的稳定性修饰，可直接应用于体内转染
☆ 低细胞毒性，可对细胞持续使用，延长靶基因的沉默持续时间
图注：Accell™ siRNA 操作步骤
2. Dharmacon可提供的shRNA产品类型
1）GIPZ™慢病毒载体shRNA——模拟microRNA设计的shRNA，高效低毒，保证沉默效率
☆ Dharmacon针对人和小鼠的每个基因分别设计了多条shRNA，从而保证沉默效率
☆ TurboGFP报告基因和shRNA受同—启动子启动表达，监测shRNA表达效果
☆ 可用于转导原代细胞或非分裂细胞
☆ 提供甘油菌克隆及克隆set，可利用puromycin筛选稳定细胞株
图注：GIPZ shRNA质粒载体元件示意图
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