比色法、化学发光法原理

比色测定法利用酶联识别分子与合适的可溶性生色底物结合来标记分子。

许多比色法依赖于链霉抗生物素或生物素的高亲和力。一级抗体(或DNA)由生物素标记，并被交联某个酶，如交联碱性磷酸酶的链霉抗生物素识别。一旦加入碱性磷酸酶的作用底物，如溴氯吲哚磷酸/氨蓝四唑(BCIP/NBT)，就会生成不溶性有色产物。产物肉眼可见，也可利用分光光度计定量。

化学发光测定法利用放射自显影采用的大多数硬件和技术。结合探针的信号是基于酶(如辣根过氧化物酶)和化学发光分子[如鲁米诺(发光氨)]之间发生的化学反应，反应发出的光可以作用到膜上被检测，就像放射性同位素一样，这种信号也可以通过成像被检测。探针可以从膜上除去而使膜被再次使用。化学发光测定法比比色测定法更加灵敏，测定中的酶可以放大信号。

Amdex高效结合:比色测定法的例子

Western 印迹的 ECl,检测法是化学发光测定法的一个例子，它利用辣根过氧化物酶催化产生光，转移到膜上后，该膜与一级抗体温育，不结合的抗体被洗掉。

ECl测定:化学发光测定系统的实

然后已交联HRP的能识别一抗的二抗再与该膜一起温育，HRP催化底物鲁米诺氧化释放出光。这种光是化学增强的，可被记录在感光片上。整个检测过程要花几分钟，曝光时间也是几分钟，或者几秒。利用链霉抗生物素-过氧化物酶试剂，ECL法也可以检测生物素标记的抗体。

ECFWestern印迹试剂盒，化学荧光系统实例

荧光素标记/抗荧光素抗体和地高辛标记/抗地高辛抗体是另外的常与酶催化发光相联的体系。

化学荧光测定的原理及样品制备与化学发光测定非常相似，差别是产物的检测不同。化学荧光测定连上一个荧光分子作为第二或第三抗体，需要激光或高强度光源激发，胶片不能用于记录信号。

化学荧光测定的一个例子是ECF Western印迹试剂盒(Amersham)利用荧光标记的抗鼠或抗免二抗来识别一抗。二抗可以通过荧光扫描或荧光成像设备，被记录，信号放大是必需的，通过实用抗荧光素的碱性磷酸酶连接的三抗和ECF试剂可以实现。碱性磷酸从化学荧光底物水解下磷酸基团，产生一个高荧光的产物，产物吸收450nm光，发射540~560 nm的光。