Lumit®PPI技术应用：生化水平高效监测KRAS与cRAF的相互作用
Lumit®Anti-Tag PPI 技术
用于监测KRAS与cRAF的相互作用
KRAS 是RAS 超家族成员，调控细胞生长、分化和增殖。KRAS 通过与GDP 和GTP 的相互作用分别切换非活性和活性状态。这些转换受鸟苷酸交换因子（GEFs）和GTP 酶激活蛋白（GAPs）调控，GEFs 促进GTP 结合，GAPs 水解GTP 并重启循环。
KRAS 是人类癌症中最常发生突变的致癌基因之一。最常见的突变发生在12、13 和61 密码子，这些突变被认为会干扰GAP 介导的水解作用，导致活化KRAS 的积累。
本文描述利用蛋白标签的Lumit® 蛋白相互作用免疫检测来监测KRAS与效应蛋白c-RAF 的相互作用。该技术还可应用于：
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监测 KRAS 突变体和 RBD-CRAF 之间的相互作用
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监测酪氨酸激酶的小分子抑制剂
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监测 PROTAC 介导的二元和三元复合物形成
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E3 连接酶 Cbl-b 的自泛素化
01
Lumit® Anti-Tag PPI技术原理及流程
Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents以商品化纯化蛋白质的常用亲和纯化标签作为直接分析物，包括：6HiS、GST、FLAG®，生物素以及人lgG。NanoBiT® 萤光素酶是一种结构互补性报告基因，非常适合进行相互作用研究。更多产品详情请查看：新品发布 | 简单、快速、高灵敏度的蛋白质互作检测系统
图1.Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents检测原理。
图2.Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents检测流程。
02
用于监测KRAS与cRAF的相互作用
图3.评估 KRAS 突变体对 RBD-C-RAF 亲和力的差异及 AMG510 的抑制效应。(A)使用 BiT 标记抗体检测时，RBD-C-RAF-GS与浓度递增的 KRAS-6HIS(野生型或突变体(相互作用导致发光信号增强。(B)AMG510特导性抑制KRAS(G12C)/RBD-CRAF 相互作用，而对野生型及其他 KRAS 突变体(如 G12D/G12V)影响甚微。标注浓度为各孔终浓度。
实验操作流程：
1. 配制 KRAS 交换缓冲液(1xTBS/5mM EDTA/0.5mM MgCl2/1mM DTT)，加入 GTP 至终浓度 10μM。
2. 在 KRAS 交换缓冲液中制备 KRAS 及 KRAS 突变体的梯度稀释液。每孔加入 10μl。
3. 震荡孵育 10 分钟，使活化的 KRAS-GTP 形成。
4. 加入 MgCl2 至 10mM 以螯合 EDTA 并稳定 GTP 结合的 KRAS。
5. 加入 10μl用 1x TBS/1mM DTT 稀释的 200nM RBD-c-RAF，震荡孵育 30 分钟。
6. 加入20ul 用 1x Lumit® lmmunoassay Dilution Bufer A 稀释至 1.5ug/ml 的抗 6HIS-LgBiT 和抗 GST-SmBiT。
7. 震荡孵育 30 分钟。
8. 每孔,加入 10ul 按 1:50 比例用Lumit® |mmunoassay Dilution Buffer A 稀释Lumit® Detection Substrate A。
9. 震荡孵育 2 分钟。
10. 检测发光信号。
11. 抑制实验中，将200nM KRAS(G12C)突变体与不同浓度的小分子抑制剂 AMG510 在缓冲液(使用 1xTBS/1mM DTT制备中预先孵育，使抑制剂与靶点充分结合，后续完全遵循标准 Lumit® lmmunoassay步骤。(详细操作指导请查阅说明书 TM723)
03
Lumit® 和 HTRF 技术对比
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指标 |
HTRF |
Lumit |
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仪器要求 |
高 需专用TR-FRET功能的酶标仪 |
低 仅需具有发光检测功能的酶标仪 |
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试剂价格 |
高 |
中 |
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检测时间 |
大于4小时 可能需要过夜孵育 |
0.5-2小时 |
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动态范围 |
宽 |
更宽 |
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是否均质法 |
均质法 |
均质法 |
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操作步骤 |
加样-检测 |
加样-检测 |
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样品消耗 |
20μl |
20μl |
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适用96/384孔板高通量 |
适用 |
适用 |
Lumit® Anti-Tag 产品列表
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产品 |
示例目录号 |
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Lumit® Anti-6His |
W1600 |
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Lumit® Anti-GST |
W1620 |
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Lumit® Anti-DYKDDDDK* |
W1640 |
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Lumit® Streptavidin |
W1660 |
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Lumit® Anti-Human IgG-LgBiT and -SmBiT |
Please Enquire |
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Lumit® Detection Reagent A |
VB2010 |
*Anti-DYKDDDDK 识别常用于标记蛋白质的FLAG® 标签。
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