【小优细节君】盘点细胞增殖标志物Ki-67的免疫学检测（WB/IHC/流式）要点
1983年，德国Kiel大学的研究团队测试出一种与细胞增殖相关核抗原反应的抗体，并将其编号命名为Ki-67。他们预测Ki-67会成为简单快速评估肿瘤中增殖细胞比例的有力工具，而这个抗体不负众望，多年来在肿瘤诊断中兢兢业业发挥作用。今天，小优细节君将和您一起盘点WB、IHC/IF、Flow Cytometry这些免疫学方法检测Ki-67蛋白过程中需要注意的操作点。
我们首先回顾一下Ki-67 的结构图。Ki-67由MKI67基因编码，包括N端叉头相关（FHA）结构域、蛋白磷酸酶1（PP1）结合结构域、包含串联重复的大中心区域和C端LR（富含亮氨酸/精氨酸）染色质结合结构域。转录后形成的最常见两种 Ki-67剪切体分子量分别是319kDa、359kDa。
图1 Ki-67结构示意图
WB法检测Ki-67
Ki-67蛋白质水平是周期性的，静止细胞和刚进入细胞周期的细胞具有较低的表达水平，在有丝分裂时达到峰值，然后下降，在G1期进一步下降，在下一个细胞周期再次上升。即Ki-67的高表达是细胞周期进入的晚期标志，在深度静止或衰老的细胞中检测不到Ki-67。通过血清和药物处理，可以使Ki-67水平保持在适合检测的阶段。
图2 Ki-67蛋白质水平周期性变化
作为核蛋白，建议选择含有脱氧胆酸钠的裂解液或者Laemmli buffer，辅以冰上超声的操作，以确保核膜被破碎，蛋白能够充分释放。超声条件是10-15s，3 次(期间每次间隔10s)，超声频率是30%－40%，电流30A。如果没有超声仪，可用1ml 带针头注的射器冰上反复抽吸10-15 次，直到裂解液澄清好吸为止。
还记得我们讲过的大分子检测方法吗？（【小优细节君】怎么做好mTOR这种大分子量的wb？），更换大分子量marker，选用低浓度凝胶或者高质量的梯度胶，转膜效率更是重中之重。
使用药物处理，使细胞周期停滞在某一阶段的同时，也要注意这种处理的副作用。例如，CDK4/CDK6处理，停留在G1期的细胞中Ki-67蛋白被降解涉及泛素-蛋白酶体系统，添加G132抑制蛋白酶体可以防止Ki-67蛋白的损失。
图3 添加MG132减少Ki-67蛋白损失
免疫组化/荧光法检测Ki-67
临床上，Ki-67指数是评估肿瘤细胞增殖活性的重要指标。
对于免疫组化实验，最常见的实验条件如下：
固定剂: 甲醛
修复方式: pH=6的柠檬酸盐缓冲液，高压锅或者微波炉进行热修复
Ki-67抗原优先在细胞周期的晚期G1、S、G2和M期表达，而G0期缺乏Ki-67表达。免疫电镜下观察Ki-67的亚细胞定位，会发现不同时期定位的差异：在间期细胞中，Ki-67免疫反应性定位于核仁，主要位于核仁皮层，特别是核仁颗粒成分的区域被强烈染色，核仁外可见弱点状核质免疫染色。在前期，Ki-67抗原定位在浓缩染色质的表面。中期则定位在染色体的表面。在细胞分裂后和新核仁形成之前，Ki-67位于核质中。
图4 细胞周期中Ki-67的定位
对于免疫荧光，尤其是细胞免疫荧光，就要注意破膜这一步骤。
使用0.5% Triton X-100室温下通透1h是最常见的方式；
某些抗体的说明书中，会提示在封闭液和抗体稀释液中加入0.3% Triton X-100，以此取代专门的通透步骤。
流式细胞术检测Ki-67
检测细胞层面的Ki-67，流式细胞术是定量更为方便的一种方法。
通过Ki-67判断细胞周期时，有以下推荐的实验方案：
单染Ki-67抗体：使用-20°C预冷的70%冷乙醇作为固定破膜剂。涡旋使细胞呈悬液状同时滴加乙醇，有效减少细胞聚集。
Ki-67与其它蛋白marker共染：表染之后，用多聚甲醛固定细胞，再进行通透处理。之后使用的所有缓冲液中，添加0.5%皂苷以破膜。
图5 FCM法检测Ki-67结果示例
以上就是本期小优细节君的全部内容，样本处理、裂解、固定、破膜，这些精华都吸收了吗？如果您有其它感兴趣的靶点和实验，欢迎在评论区回复。
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