实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型构建关键工具：百日咳毒素

多发性硬化症(MS)是一种慢性免疫调节疾病，主要影响中枢神经系统(CNS)，可能导致大脑和脊髓（中枢神经系统）失能。目前MS的治疗手段并不能有效地同时解决身体残疾和抑郁症。罗氟司特是一种具有抗炎特性的磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制剂，已显示出治疗自身免疫性疾病的前景。

2024年4月1日，东南大学医学院神经精神病学研究所附属中大医院神经内科张志珺教授团队在Journal of Affective Disorders上发表题为“Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor functionand depressive symptoms in multiple sclerosis”的研究论文，该研究表明罗氟司特有可能成为改善MS抑郁症状和急性时相运动障碍的潜在药物，其抗炎、减炎和抑制小胶质细胞激活的特性提示其在MS治疗中的潜力。IL6、IL1B和TNF是MS和抑郁症共有的关键基因，其编码的细胞因子存在蛋白质相互作用。IL-6可能在多发性硬化症相关抑郁中发挥重要作用，IL-6拮抗剂可能成为改善多发性硬化症抑郁的潜在治疗策略。研究结果为进一步阐明MS和抑郁症的发病机制提供了重要线索。

在该研究中，研究人员采用实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型，研究罗氟司特的作用。评估运动功能障碍和抑郁症状，并进行组织病理学分析，评估其抗炎特性。流式细胞术检测药物对大脑小胶质细胞的影响。用双抗体夹心法检测大鼠海马区TNF-α，IL-1β和IL-6水平。

实验动物

11周龄雌性SD大鼠（上海实验动物中心提供），这些大鼠生活在受控的环境条件下（包括12h的明暗循环和20-22℃的室温）。

EAE诱导

将等量新鲜匀浆的豚鼠脊髓与含10mg/mL卡介苗(BCG)的完全弗氏佐剂(CFA)用注射器在冰水混合物中大力混合，制成油包水乳剂。将上述乳剂按400μL总体积皮下注射于大鼠腿垫内。阴性对照组注射等体积的0.9%氯化钠溶液与完全弗氏佐剂混合的乳剂。分别于免疫后0h和48h腹腔注射0.1mL百日咳疫苗悬液（Absin，abs42024900）。

EAE症状评估

研究人员评估了从EAE诱导开始到安乐死为止的运动功能相关神经行为缺陷。评分等级如下：

0级，无明显运动障碍；1级，尾部瘫痪；2级，后腿瘫痪；3级，后腿完全瘫痪；4级，四肢瘫痪；5级，垂死或死亡。

百日咳毒素（Pertussis Toxin，PTX）是鲍特氏菌属百日咳杆菌所产生的一种主要毒力因子，具有多种生物学活性，能引起百日咳众多的临床症状，同时也是主要的免疫原。与大多数哺乳动物培养细胞结合并特定靶向G蛋白，抑制G蛋白在信号通路中的生理功能。因其能依赖Gi家族的蛋白偶联受体抑制信号通路，PTX成为细胞生物学研究中的重要工具。

图1 用Gαi抑制剂PTX(50ng/ml)和Gαq抑制剂FR900359(1μM)预处理

对HEK293T细胞中QRFP26(1μM)受体介导的Ca2+内流的影响[1]。
 

同时，PTX是所有目前可用疫苗的主要成分，且该毒素抗体的存在与保护儿童免受百日咳疾病相关。因此，PTX可能继续作为百日咳疫苗的重要组分。

但由于PTX为外毒素，通过对其结构基因进行遗传修饰来脱毒的方法可能激发疫苗生产商从化学脱毒的无细胞百日咳疫苗（Acelluar pertussis vaccine，APV）转变为遗传脱毒的APV。遗传脱毒的PTX安全性和免疫原性优于化学脱毒的PTX。但即使转向遗传脱毒的PTX，APV可能仍不能防止百日咳鲍特菌感染。为实现该目标，需继续对百日咳的致病机理、免疫学变化以及抗原成分进行研究，从而研发一种具有长期免疫力和防止百日咳鲍特菌感染的新型百日咳疫苗[2]。

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1.J Affect Disord. 2024 Apr 1;350:761-773. doi: 10.1016/j.jad.2023.12.074. Epub 2024 Jan 14. PMID: 38220100.

2. J Neurochem. 2021 Jul;158(2):138-152. doi: 10.1111/jnc.15337. Epub 2021 Mar 17. PMID: 33655503.