文末一键获取WB实验超全技巧
荧光WB（Fluorescent western blotting）是指用荧光标记抗体来检测蛋白表达水平的WB技术。荧光WB有信号稳定、线性度好、可以多重检测这些优点，受到大家的欢迎，应用也越来越普及。但是，高背景问题限制了荧光WB的灵敏度。你在做荧光WB的时候，有没有被高背景困扰过呢？小优细节君就针对这个问题来分析讨论一下吧。
由于搭配了荧光检测系统，荧光WB中的背景比化学发光WB中的背景更为复杂。除了抗体与膜的非特异性结合引起的背景，还有自发荧光背景。封闭液、膜的种类和干湿差异、检测仪器的激发/发射条件，这些不同因素的组合将产生具体情况各不相同的背景。
膜
使用低荧光PVDF膜（FL）、NC膜和两个不同型号的PVDF膜做对比，结果显示，无论在哪个通道中，低荧光PVDF膜的背景都低至可以忽略。同时可以看出，在激发波长为635nm的Cy5通道中，普通NC膜和PVDF膜（B）的自发荧光最弱。
图1 低荧光PVDF膜有低背景（Ex: 473/532/635nm）
而在使用Odyssey 700nm和800nm这两个通道时，低荧光PVDF膜（LFP）的背景也明显低于NC膜。
图 2 低荧光PVDF膜有低背景（NIR: 700/800nm）
封闭液
在荧光WB实验中，哪种封闭液的效果最好？这应该是大家最关心的问题了。对比仅用TBST（即没有封闭液）和BSA、牛奶、明胶、PVP这四种封闭液的效果，结果显示其它封闭液降低背景、突出特异性信号的作用并没有强于牛奶。考虑到经济因素，整体来看，牛奶仍然是封闭液的最佳选项。
图3 不同封闭液效果对比
吐温20
在使用荧光WB法检测低丰度蛋白时，整体载量高且背景自发荧光较低的NC膜是一个折中的选择。为了获得更强的信号，试剂供应商会建议将膜干燥后成像，但同时需要去除封闭液中的吐温20，有一项研究解释了这样操作的必要性。
将膜在不同的液体中浸泡，分为三个处理组：水、TBST或TBST浸泡后水洗，模拟了WB实验中膜的使用场景。结果发现，使用不同的液体浸泡后，湿膜状态下检测到的背景值并没有很大差异，而膜干燥后，TBST组的背景明显偏高了。
图4 去除TBST/吐温20可以降低背景
那么，我们来总结一下，荧光WB实验中，应该注意哪些条件，能降低背景呢？
01
膜的选择和处理
在检测高表达量的蛋白，希望有非常低的背景时，低荧光PVDF膜是首选。如果检测的靶标是低丰度蛋白，又考虑到价格成本，可以使用NC膜。相比普通PVDF膜，NC膜通常有更低的背景。
02
合适的封闭液
牛奶是非常容易获取且封闭效果好的封闭液，5%的浓度较为合适。也可根据使用的二抗和成像系统匹配的其它合适的封闭液，例如BSA、intercept。
03
吐温20添加
膜干燥后再成像能够增强信号，同时注意去除封闭液中的吐温20，否则可能引起高背景。
另外提醒大家，化学法WB和荧光WB各有其优点，如果荧光WB不能得到满意的结果，还是可以尝试化学发光检测。
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参考文献：
Multiplex Fluorescent Blot Detection Guide : A Troubleshooting Guide, Bio-Rad.
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