分子信标是一种能够形成茎环结构的单链寡核苷酸杂交探针。在其中间位置，存在一段能与目标序列互补配对的序列，称为环。环序列的两侧添加有能够自身互补配对的序列，称为茎。分子信标茎序列的两侧，分别共价修饰有一个荧光基团和一个淬灭基团。
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在没有目标序列的情况下，分子信标会形成茎环结构，导致修饰在两端的荧光基团和淬灭基团靠的很近，荧光基团的光会由于共享电子对的形成而被淬灭。一旦分子信标遇到其靶序列，就会由于环部位置与靶序列互补配对而形成“信标-靶标”杂交产物，这种杂交体的刚性结构会迫使茎环杂交结构打开，分子信标的构象发生变化，致使荧光基团与淬灭基团远离，逃脱其淬灭范围，最终导致发光。
图中的分子信标像一条蛇一样，盘旋结合在模板上，导致荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团发光。
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在诊断分析中，分子信标可以用于检测扩增产物，由于未杂交的分子信标不会发出荧光，因此在分析产物数量时不必将其与杂交之后的分子信标分离。我们仅需要在基因扩增前将分子信标加入反应体系，即可实时检测扩增体系的荧光变化。在这个过程中，反应体系始终是处于封闭状态，不会对其他样品或反应体系造成交叉污染。此外，分子信标具有很高的检测特异性，因为非特异扩增子或引物二聚体不太可能具有分子信标的靶序列，所以荧光的产生完全归因于目的扩增子的合成。
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我们可以合成具有不同颜色荧光基团的分子信标，使其能够在同一反应中同时进行不同靶标的测定。例如，多重PCR分析可以包含许多组不同的引物，每组都能够结合不同的基因片段扩增独特的序列，此时加入相应的带有不同颜色荧光基团的分子信标，每个分子信标特异地结合其目标扩增子。从结果中的荧光颜色及其循环数中就可以看出样本中对应的基因片段类型和数量。并且，由于PCR分析的固有性质，使用分子信标能够从大量样本存在的环境中确定稀有靶标的丰度。
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分子信标具有超乎想象的特异性，其能够准确区分哪怕只有一个核苷酸区别的靶标。分子信标之所以如此“挑剔”，是因为其本身存在两种稳定的物理结构：当与靶标杂交时，能量储存于环-靶标双螺旋中；而游离时，能量则储存于自身茎部的双螺旋中。一个设计良好的分子信标，结合靶标的稳定性恰好刚刚高于自身茎环的稳定性，因此，分子信标会自发地形成探针-靶标杂交体。然而，如果靶标中有单个核苷酸与分子信标的探针序列不互补配对，则探针-靶标杂交体将不太稳定。在这种情况下，分子信标的茎部螺旋比错配的杂交体更稳定，分子信标将不会与靶标结合。可以将分子信标理解为一种“分子开关”，只有与其完全互补配对的靶标存在时，这个开关才会打开发出荧光，而其他情况则分子开关呈关闭状态保持淬灭。
因此，分子信标是用于遗传筛选，SNP检测和药物遗传学应用的诊断测定的理想探针。例如，为了确定特定基因座上的基因型，在两种不同的分子信标存在下扩增目的遗传区域，一种与野生型等位基因完全互补并用特定颜色的荧光团标记，另一个与突变等位基因完全互补，并用不同颜色的荧光团标记。如果测定结果仅产生了第一种荧光颜色，则该个体在该基因座处是纯合野生型。如果测定结果仅产生第二种荧光颜色，那么个体是纯合突变体。最后，如果产生两种荧光颜色，则该个体是杂合的。
