不少研究者需要对自己的目标基因外显子进行筛查，以确定其中的SNP位点或者突变位点，此时，需要对该基因的全部外显子分别设计扩增引物，分别进行PCR扩增，然后进行测序。
当基因的外显子数量比较少的时候，倒是可以分别找到每个外显子，然后划定包含该外显子的区域分别进行设计。
例如Human IL6基因，其只有5个外显子，下面以该基因1号外显子为例，介绍一下设计流程：
1. 找到NCBI中该目的基因的页面
详细查找流程在之前已经介绍过了，点此回顾。
2. 基因页面中点击右侧“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”按钮，跳转到参考序列入口：
此时有两个主要的部分，分别为 Genomic 以及 mRNA and Proteins ，鼠标选中并复制Genomic中的基因登陆号NG_011640.1 （绿色）。
3. 在新的NCBI页面中，选择Nucleotide，粘贴该基因号，并搜索，弹出的页面，即是NG_011640.1的基因页面。
4. 该页面中Feature位置中，找到左侧的任一“exon”并点击，
页面就会跳转到序列部分并标红。这段序列就是该外显子的序列，及上下游的flank序列。
5. 引物设计
有了这段序列，设计引物就很简单了，小编比较喜欢使用NCBI自带的引物设计功能：
5.1 确定目标区域位置
例如exon1，我们看到其位置在4981~5161之间，
由于一代测序的开始和末尾是测不准的，因此我们需要将exon1的所在位置扩大一下，通常前后各加60即可，即从4921到5221，记住这个范围。
5.2 进入设计页面
回到当前页面的顶端，我们会看到有Pick Primer按钮：
点击该按钮，会进入引物设计页面，此时，基因登录号NG_011640.1已经自动填写到了序列框中。
5.3 设定参数
首先我们需要限定引物设计的范围：正向引物不能超过exon1的左侧，即4921，而反向引物一定要超过exon1的右侧，即5221。
产物大小设置为一代测序比较合适的范围，如500~700。
如果需要NCBI设计特异性的引物（虽然经常不准确），则可以在Primer Pair Specificity check处进行勾选，数据库选择对应物种的基因组。
5.4 获取引物设计结果：
点击最下方的Get Primers按钮，NCBI会将基因登录号对应到基因组中，勾选该基因组，继续点击Submit提交：
一段时间之后，就得到了NCBI设计的引物结果，从分布图中可以看到，NCBI设计的8对引物，都是完整包含了exon1及其flank序列的：
最后，就在结果中选取设计比较合理（看着比较顺眼）的就可以啦~
然而，某些基因的外显子数量非常多，例如Human EGFR基因，有28个外显子，这样一个个设计实在是让人头疼。
有没有批量设计某个基因外显子引物的方法呢？小编在下篇文章中细聊。
