掌握这些细节，告别条带扭曲和低分辨率。

在分子生物学和蛋白质研究中，SDS-PAGE 是最基础却最容易翻车的实验技术之一。一个完美的条带背后，是无数细节的精准把控。下面我们将从原理出发，直击制胶、上样、电泳、染色全流程中的典型问题，助您一次性获得清晰可辨的电泳结果。

1. 基质组分（凝胶网络）

2. 缓冲组分（提供pH环境与导电离子）

3. 变性还原组分（统一蛋白质电荷与构象）

1. 胶体凝固异常怎么办？

可能的状况1：不凝固

对策：环境温度低于 20℃ 时，按比例适量增加TEMED 和过硫酸铵（AP）；冬季可将灌胶后的玻璃板置于 37℃ 培养箱加速聚合。

可能的状况2：凝固过快导致胶脆易裂

对策：减少 TEMED 和 AP 用量，尤其在室温高于 25℃ 时。

可能的状况3：浓缩胶粘稠不成形

对策：立即检查浓缩胶缓冲液 pH 值（应为 6.8），如偏离需重新配制。

2. 凝胶均匀性不好怎么办？

可能的状况1：“微笑”条带（两边翘中间凹）：

原因：厚凝胶（>1.5mm）中部凝固不均。

对策：延长室温聚合时间至 1 小时以上，或 25℃ 静置过夜。

可能的状况2：“皱眉”条带（两边下垂中间鼓）：

原因：玻璃板底部存在残留气泡。

对策：灌胶后轻敲板侧排除气泡，必要时注入缓冲液填充间隙。

3. 条带分辨率不高怎么办？

*聚丙烯酰胺的充分聚合可提高条带分辨率。

原因：①即配即用易导致凝胶凝固不充分。②4度冰箱冷藏储存导致SDS结晶，破坏凝胶均一性。

对策：①凝胶在室温凝固后，再放置 2-4 小时待其充分聚合。②避免冷藏储存未用胶。

1. 三种处理方法的选择（根据实验目标选择适当处理方式）

2. 典型问题

①“鬼带”：“鬼带”是指大分子蛋白（>100kDa）在加样孔底部形成沉淀或异常条带的现象。

成因：还原剂在加热过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠或亚基重新缔合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但其与目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见条带。

对策：煮沸后补加 DTT或Beta巯基乙醇，或添加EDTA 抑制还原剂氧化。

② 最佳上样量：最佳范围为 20-50μg/孔。超过 80μg 将导致条带弥散；低于10μg可能检测困难。

③煮沸后处理规范：样品煮沸后需冷却至室温立即上样，避免冷藏或久置导致蛋白质再折叠。

④为什么条带出现拖尾现象？

原因：样品溶解不全或分离胶浓度过高。

对策：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂（如0.5-1%脱氧胆酸钠）；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

⑤为什么条带出现纹理现象？

        原因：样品中存在不溶性颗粒。

        对策：增加超声破碎强度（30% 振幅，5 次×10 秒）；加样前离心；加适量样品促溶剂。

1. 电泳条件标准

①电压梯度设置：

浓缩阶段：80V（约 20 分钟，至溴酚蓝成一线）

分离阶段：120V（约 90 分钟，至溴酚蓝达底部 0.5cm 处）

②温度控制：槽内温度需维持 4-10℃。过高将导致条带扩散（“微笑”带）甚至凝胶变形，建议使用循环水冷却系统。

2. 典型问题

①条带偏斜：检查电极是否平衡，加样是否垂直居中。

②溴酚蓝异常迁移：当染料跑出底线而蛋白未分离时，需降低分离胶浓度或更换正确pH值的缓冲液。

③电压高但电流低（<5mA）：多为电泳槽装配错误，重点检查：内外槽是否装反、外槽液是否不足、底部绝缘橡胶是否未移除。

④条带过粗：增加浓缩胶长度至 1.5cm 以上；确认浓缩胶缓冲液 pH；降低浓缩阶段电压至 70V。

其他关键要点：

• 缓冲液 pH 是分离基础：浓缩胶 pH 6.8，分离胶 pH 8.8，偏差超过 0.2 需重新配制

• 还原剂活性决定解离程度：DTT 及 β-巯基乙醇需 -20℃ 避光保存，开封超过 3 个月建议更换

• 电泳缓冲液不建议回收：重复使用易引入杂质导致纵向条纹