生工技术 | 聊聊人全外显子捕获测序的一些细节
我们都知道，人类基因组有30亿个碱基，但是在这30亿碱基之中，只有很小的一部分序列，能够编码翻译蛋白，然后这些蛋白质在人体内发挥各种生理功能。这部分基因序列就叫做“外显子”。目前被我们确定下来的人类基因大概有180,000个，外显子区大小约占人类基因组的1.5%，约30 Mb。就这1.5%的外显子，却包含了85%的致病突变。人们顺势开发出了全外显子捕获测序技术（whole exome sequencing），借助WES可检测基因的点突变、小片段插入缺失、及拷贝数变异等信息。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得变异与疾病的关系。因此，在医学基础研究、遗传疾病筛查等领域有着广泛的运用。
相比全基因组重测序
人全外显子捕获测序有两大优势
价格低，但是外显子区域测序深度更深，平均可以达到200X。可以有效检出低频突变。花小钱，办大事；
分析更快速。因为最终总数据量在6-10G/样品，因此分析数据占用的运算资源更少，速度也会更快。
那么人全外显子捕获测序具体是怎么操作的呢？
其实，实验端主要是二个步骤，我们就来逐步介绍这其中的一些细节。
上图示例为，将提取好的基因组DNA，超声破碎。然后使用酶反应进行片段补齐、修复，加A尾。这个过程中，需要注意的包括：
超声破碎片段最好集中在200-300bp左右，不宜太长，否则可能影响捕获效率。
初始DNA投入量最好不要低于200ng，否则后期扩增循环数可能会增加，增加bias。
上图所示，是采用illumina标准的UDI接头，进行连接反应。获得了连接产物之后，采用P5，P7通用引物进行扩增，放大文库量。这个环节需要注意的是：
连接产物进行长度筛选，尽量选择可靠的磁珠；
PCR扩增循环数不宜太多，可按照说明书执行。
上图为杂交捕获示意图。其大致流程为：
将第一阶段建好的文库，按照等摩尔量混合好（一般可以是3-12个文库不等，具体看实验需求）。
在杂交缓冲液中，加入文库，通用封闭接头，biotin探针，进行杂交反应。反应时间根据产品说明书来，有的快速杂交的只需要4小时，也可以过夜杂交。因此，建议小伙伴们要合理安排实验，最好是下午杂交上，第二天一早进行下游实验。
影响最终的结果的因素比较多：文库构建是否合格，探针的设计是否合理，接头封闭效率，杂交条件包括缓冲液、杂交温度、洗脱缓冲液、洗脱温度等等。
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