双链RNA质控要点：如何不再担忧并爱上我的IVT反应
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随着mRNA疗法在临床管线中的持续扩展，开发者仍面临一个长期挑战：减少可能影响安全性和有效性的双链RNA（dsRNA）污染物。这些体外转录（IVT）的意外副产物可能引发不必要的免疫反应，并降低终产物的效力。开发者必须将dsRNA检测与控制作为工艺中的关键步骤优先考虑。在上一篇文章中，我们已从宏观层面探讨了什么是双链RNA（dsRNA）、其生物学功能以及治疗场景中检测的重要性。本文将深入分析dsRNA污染的来源、质控措施与改进策略。
基于mRNA疗法的单链RNA（ssRNA）大规模生产主要通过体外转录（IVT）完成——这是一种从DNA模板高效生成功能性mRNA转录本的酶促方法。该方法使用纯化的RNA聚合酶（如T7），通过识别DNA模板中的特定启动子序列来生成目标RNA转录本。然而，IVT反应也会产生不想要的dsRNA副产物。下文我们将探讨减少dsRNA副产物的主要质控要点与策略。
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质控挑战1：模板与序列设计
dsRNA形成的隐患
预防dsRNA的重要起点在于谨慎的模板与序列设计。当DNA模板含有重复或高度互补区域时，在转录过程中可能发生部分自退火现象，从而形成dsRNA的潜在生成区。高GC含量区域和二级结构也会导致聚合酶停滞及截短转录本的产生，这些产物可能通过排列形成双链1。
质控挑战
糟糕的序列设计会促进转录过程中的自退火，从而导致双链RNA的形成。优化的模板具有降低的互补性，有助于最大限度地减少这些不需要的副产物。
改进建议
为解决上述问题，可采用密码子优化并去除重复元件，以确保更顺畅的转录过程。同时需确认质粒在正确切割位点完全线性化。即使痕量的缺口DNA或超螺旋DNA也会破坏转录反应，导致结果不一致并增加dsRNA形成风险。
02
质控挑战2：反应条件
dsRNA形成的隐患
最佳反应条件是另一关键因素。若IVT在错误温度或时长下进行，则更易产生不完整或异常转录本，进而形成dsRNA。同样，必须严格监测反应组分（如盐、镁离子、核苷酸）的浓度，以确保聚合酶以最高效率运行且不引入错误2。
质控挑战
不理想的体外转录条件（如温度、时间或试剂水平不正确）可能导致转录不完全和不需要的双链 RNA。优化这些参数有助于生产更高质量的 mRNA，并减少副产物。
改进建议
聚合酶保真度对整体产物质量至关重要。使用高保真酶、优质反应混合液及适配经优化的工程化T7聚合酶功能的镁离子浓度，可使IVT反应更高效推进且不产生异常产物。在研发阶段需提前考虑下游开发关键试剂的来源（如Promega提供的cGMP级mRNA原料），无污染试剂可防止意外反应条件导致的退火倾向及dsRNA形成。早期识别这些关键试剂对后期阶段转化有益。
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质控挑战3：功能活性与效价
dsRNA形成的隐患
即使对初始模板和反应条件进行了优化与风险控制，仍无法保证RNA产物完全无dsRNA污染。若上述防护措施失效，则需建立全面的IVT后dsRNA检测质控策略。仅依赖单一检测指标极易漏检dsRNA副产物。常用方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）和使用dsRNA特异性单克隆抗体（如J2或K1）的斑点印迹存在严重缺陷，因其性能高度依赖抗体结合特性，可能无法准确定量dsRNA种类3。
质控挑战
开发者应采用非抗体依赖性结合检测法与功能检测法组合验证dsRNA IVT产物的纯度。
改进建议
科学家应采用更灵敏的方法验证IVT产物的纯度：建议结合非抗体依赖性结合检测法与功能检测法。生化结合检测法，如Lumit® dsRNA检测法，和基于细胞的TLR3生物测定法，通过精确、灵敏的定量以及生物学相关的先天免疫激活，可分别从功能角度为IVT产物的纯度提供关键洞见。
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继续探索dsRNA的挑战与解决方案
减少dsRNA污染需对IVT工作流程的每个阶段（从模板设计、反应设置到最终质控）保持严谨关注。本文重点分析了dsRNA副产物的常见来源，并概述了提升RNA质量以支持下游应用的策略。此篇文章是我们关于mRNA疗法中双链RNA系列文章的延续。若您错过了首篇内容，请务必阅读我们关于dsRNA生物学作用及其检测重要性的探讨。敬请关注本系列最后一篇文章，我们将探讨化学修饰核苷酸如何提升治疗性能——同时为dsRNA检测与定量带来新挑战。
参考文献：
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Arnaud-Barbe, N., V. Cheynet-Sauvion, G. Oriol, B. Mandrand, & F. Mallet. (1998) Transcription of RNA templates by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 26: 3550-3554.
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Guo, L., Z. Liu, S. Song, W. Yao, M. Yang, & G. Chen. (2024) Maximizing the mRNA productivity for in vitro transcription by optimization of fed-batch strategy. Biochem Engineering Journal. 210: 109412.
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Bonin, M., J. Oberstrass, N. Lukacs, K. Ewert, E. Oesterschulze, R. Kassing, & W. Nellen. (2000) Determination of preferential binding sites for anti-dsRNA antibodies on double-stranded RNA by scanning force microscopy. RNA. 6: 563-570.
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Lumit® dsRNA Detection Assay |
100 assays 500 assays |
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