分子生物学实验的基本特点是微量操作步骤多。微量操作规范与否,决定着整个实验的成败。微量操作的精髓可以归纳为“批量配液原则、准确加样手法”。

批量配液原则是最为重要的指导思想,适用于所有的微量操作。它包含两层含义:一是将反应所需的各种试剂预先配制成母液,然后每次从母液开始进行工作液的配制,这样大大简化了配液步骤并且可以方便地改变母液浓度以配合获得合适的母液加人体积,便于准确加样;二是当需要进行多个平行反应时,先将相同的反应成分统一配制成大包装的工作液,混匀后再分装到每一个反应,这样可以保证所有反应条件具有一致性,既简化了操作流程,又提高了平行反应之间的可信度和重复性。准确加样手法是贯彻批量配液原则的具体实施途径,主要涉及两方面,一是确保样品确实加入了反应体系并且所加体积准确,这有赖于对微量移液器的正确使用和培养良好的加样习惯;二是时刻确保所有反应成分汇集于试管底部并且混合均匀，这需要在每次样品处理后及时地进行“离心一混匀-再离心"三步操作。

一、母液的配制与保存

1、母液的配制 

预先将分子生物学实验所需的常用试剂以母液的形式配制,具有两个明显的优点:一是母液通常一次配制、多次使用,从而减少每次称量试剂的麻烦;二是母液的浓度和体积均显著高于工作液中的实际需要量,因而能够减少极微量试剂在每次称量时可能造成的误差。

(1)配制方法:确定所需母液的浓度和体积,然后按照标准方法配制。母液是进一步配制工作液的依据,因此母液浓度必须配制准确,需要特别注意固体试剂的称量、液体溶剂的量取、溶液pH值的调节3个环节均准确无误。读者可以直接参考《分子克隆实验指南》等实验工具书上的配方。

(2)配制建议:根据试剂最终在工作液中的实际用量来灵活调整所需母液的浓度,从而相应地改变加人母液的体积,以便于提高加样的准确性。例如:要配制含有终浓度为5umol/L某试剂的1ml工作液,如果母液浓度是5mmol/L,需向1ml工作液中加人1ul母液;如果母液浓度是0.5mmol/L,则需加人10ul母液,显然进行10ul加样操作误差更小。

2、母液的保存 

母液一旦配制好,就必须妥善保存,特别要注意保存条件,有的母液需要无菌保存,有的需要低温保存。每次使用前,先仔细观察母液是否出现沉淀、霉变等异常现象。使用时应用干净的吸头或吸管移取母液,避免交叉污染对于较昂贵、较关键的母液,配制后及时进行分装并在合适条件下保存,能够使每次实验时所用母液的条件完全一致,有效地保证母液可靠、无污染,提高实验的准确性和可重复性。

二、工作液的批量配制

需要配制多个平行反应的工作液时,通常采取集中配制、单独分装的策略,这样比分次配制多个相同的工作液更加省时省力,更重要的是,还能保证每个平行反应所处的反应条件完全一致,有助于准确定量比较。为方便起见,以放射性核素定量分析为例,说明工作液批量配制思路与具体操作,读者可举一反三地应用于分子生物学的其他实验。

该实验利用放射性核素标记底物的体外激酶反应,比较10种小分子化合物对于该酶促反应的激活或抑制效应,每种分子做2个反应。

1、单个管内的反应体系 

每管应加入0.1ul[γ-32P]-ATP、1uI非标记ATP、1μl蛋白底物、1ul激酶、1ml小分子化合物、2ul 10x 反应缓冲液,总体积用H2O补足到20ul。如果每种试剂单独加入，操作误差会很大。

2、实际配液思路 

整个实验10种分子要设20个反应,体系中除小分子化合物外,其余反应组分完全相同,且各组分所加体积很小。如果将各组分分别加到20个反应管,操作次数多,量小,误差大,各管的均一性肯定不好,尤其是0.1ml的放射性核素标记的ATP难以准确加样,势必影响放射性核素定量的准确性。实际工作中,可以将除待测化合物外的所有成分先配制成20份的反应混合液:即取20μI ATP、20ul蛋白底物、20μl激酶、40μl 10x缓冲液、2ul[γ-32P]-ATP,用H2O补足至 380μl,混匀。实验开始,首先依次在各管内加入19uI混合液,再分别加入1ul不同的小分子化合物。显然，体积增大后加样就容易操作准确了。

微量操作中难免出现加样损失和误差,因此，通常要配制比实际反应份数再多1~2份的批量工作液,在本例中,实际需要配制21份反应工作液:多配制的部分是为了留有余量,以保证工作液的总量足够分装到最后1份反应。