研究细胞凋亡信号通路，如同解开生命精心设计的“死亡程序”。一个清晰的思路能帮助我们层层深入：首先建立可靠的模型诱导凋亡，接着确认其典型表型，然后捕捉关键的分子差异，最终深入剖析其作用机制。本文即循此脉络，结合凋亡检测的关键技术与常见陷阱，为您的探索之旅提供实用导航。

🔔提示：由于干货较多,篇幅较长,阅读大约需15分钟,建议先收藏哦！

第一步

构建模型—启动凋亡程序

任何通路研究的起点，都是建立一个能稳定、特异诱导目标表型的模型系统。对于凋亡研究，这意味着选择合适的细胞类型和凋亡诱导剂。根据凋亡触发机制的不同，主要可分为四大类途径，选择合适的诱导剂至关重要。

细胞选择

依据研究目的，可选用原代细胞（更接近生理状态，但操作复杂）或永生化细胞系（易培养、重复性好，如HeLa, Jurkat, MCF-7等）。关键需确认：

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目标细胞是否表达相应途径的关键受体（如Fas/CD95对于外源性途径）。

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目标细胞对所选诱导剂是否敏感（如某些细胞系对特定DNA损伤剂有抗性）。

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研究穿孔素/颗粒酶途径，通常需要免疫效应细胞（如CTL, NK细胞）与靶细胞共培养系统。

诱导剂选择：

剂量与时间摸索：

这是模型成功的关键！需针对所选诱导剂和细胞类型，设置浓度梯度和时间梯度（如0, 6, 12, 24, 48小时），通过后续表型检测（如细胞活力CCK-8/MTS，或形态学初步观察）确定最佳诱导条件——既要达到显著凋亡效果（如20-50%凋亡率），又要避免大规模坏死干扰（PI单阳性细胞过多）。

模型构建的核心目标，是获得一批处于可控凋亡进程的细胞群体，并明确其触发的核心凋亡途径。

模型构建后，我们首先需要回答的问题是——凋亡真的发生了吗？它进展到了哪个阶段？这需要我们系统性地捕捉凋亡的“足迹”，即表型确认。

第二步

确认表型—捕捉凋亡的“足迹”

凋亡是一个多阶段、特征鲜明的程序性过程。表型确认旨在利用多种检测手段，从不同角度（细胞膜、细胞器、酶活性、细胞核）描绘凋亡的“肖像”，并判断其进程阶段。

早期表型：细胞膜与线粒体的警报

现象：磷脂酰丝氨酸(PS)外翻（丧失膜不对称性）、线粒体膜电位(ΔΨm)崩溃。

检测方法：

Annexin V/PI双染 (PS外翻)

原理：荧光Annexin V特异性结合暴露于细胞膜外的PS；PI渗透性差，仅进入死细胞。双染可区分正常、早期凋亡、晚期凋亡/坏死。

Annexin V/PI双染实验常见问题排查表

关键注意：

一活（细胞活性） → 二钙（缓冲液含钙） → 三对照（四对照齐全） → 四避光（全程避光操作） → 五调机（电压补偿校准）

C-1染色 (ΔΨm)

原理：正常线粒体时JC-1形成红色聚集体；ΔΨm下降时解聚为绿色单体。红绿荧光比值下降提示凋亡。

JC-1染色常见问题排查表

关键注意：

1、JC-1需避光现配现用（工作液30min内使用）；2、设置CCCP阳性对照；3、分析时用红/绿荧光比值而非绝对强度。

执行期表型：Caspase的激活风暴

现象：关键Caspase酶原（如Caspase-3, -8, -9）被切割激活，底物蛋白（如PARP, 核纤层蛋白）被切割。

检测方法：

Caspase活性检测 (如Caspase-3/7)

原理：使用荧光底物（如DEVD-AMC），被活化的Caspase切割释放荧光基团，荧光强度反映酶活性。

Caspase活性检测常见问题排查表

关键注意：

1、裂解后立即检测（Caspase易降解）；2、设置不加底物空白对照；3、活性单位需用蛋白浓度校正。

WB检测切割

原理：抗体识别Caspase酶原（全长）和其活化片段（切割后小片段），或切割底物（如全长PARP vs 89kD片段）。

WB检测切割常见问题排查表

关键注意：

1、样本表达量；2、设置阳性对照，用凋亡诱导剂处理；3、内参对照确认实验体系正常。

晚期表型：结构崩解与“死亡印记”

现象：染色质凝聚、核碎裂、DNA片段化、凋亡小体形成。

检测方法：

TUNEL (DNA断裂)

原理：末端转移酶(TdT)将标记的dUTP连接到DNA断裂产生的3'-OH末端，直接标记凋亡细胞核。

TUNEL检测常见问题排查表

关键注意：

1、固定时间≤30min（4% PFA）；2、设DNase I处理阳性对照；3、荧光法需避光封片后立即拍摄。

形态学观察 (Hoechst 33342/DAPI/PI/电镜)

原理：染色DNA、高分辨率显微镜下直接观察凋亡特征。

形态学观察常见问题排查表

关键注意：

1、凋亡诱导阳性对照（如星形孢菌素）；2、联合染色：Hoechst（核形态）+ PI（膜完整性）；3、拍摄时用100×油镜。

观察到明确的凋亡表型（如PS外翻、Caspase活化、核碎裂），我们便捕捉到了凋亡的“现象”。接下来需要追问的是——哪些关键分子在这个“死亡程序”中发生了显著变化？这引领我们进入差异表达分析阶段。

第三步

锁定差异—寻找凋亡的“关键分子”

表型确认后，目标是筛选在凋亡过程中表达或活性发生显著变化的关键分子。这些分子通常是凋亡通路的核心组件或调控因子。

筛选策略：

靶向性筛选：基于凋亡通路知识及模型所选的诱导途径，利用WB、qPCR、免疫荧光(IF)等技术，检测途径特异性的已知关键分子差异：

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外源性途径：检测死亡受体(Fas, TNFR1)、配体(FasL, TNF-α)、接头蛋白(FADD)、Caspase-8/10的活化、cFLIP的表达/抑制。

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内源性途径：检测Bcl-2家族成员表达/比值(Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bid切割tBid)、细胞色素C释放（胞浆组分）、Smac/DIABLO、AIF、Caspase-9活化。内质网应激相关：检测GRP78/BiP, CHOP, Caspase-12(人主要为Caspase-4)活化。

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穿孔素/颗粒酶途径：检测颗粒酶B (GrB)活性（可用特异性底物如IETD-AMC）、Bid切割(tBid)、Caspase-3直接活化（可能不依赖Caspase-8/9）。

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Caspase家族：检测特定Caspase（如Caspase-3, -7）的活化程度，及其主要底物（如PARP, ICAD）的切割。若使用抑制剂，需验证其有效性（抑制Caspase活性及下游事件）。

非靶向筛选：当研究新机制或复杂调控时，可采用组学方法（如转录组测序RNA-seq、蛋白质组学）全面筛选差异基因/蛋白。这是发现新调控因子的有力工具，后续需将差异分子锚定到具体的凋亡途径中进行分析。

聚焦核心分子：通过上述筛选，结合文献和通路背景，锁定1-2个变化最显著、功能最核心且与诱导途径关联性强的分子（如外源性模型中FADD显著聚集，内源性模型中Bax显著上调并转位，颗粒酶途径中GrB活性高且Bid被切割，Caspase抑制剂模型中凋亡被显著抑制）作为后续机制研究的突破口。

这里小优细节君也将部分关键靶点在WB实验中常见共性问题的优化Tips列在下方，供大家学习参考：

Caspase-3

CST#9661

1. 细胞发生凋亡后贴壁细胞会变得难贴壁，需离心收集所有的细胞

2. 保证足够的蛋白上样量，组织样本推荐50~100μg，细胞样本推荐20~50μg

3. Caspase-3 剪切体分子量较小，注意转膜时间不能太久，膜要使用0.22μm

4. 前体和剪切体可分开曝光，或者使用专门识别剪切体的抗体

点击这里了解详情

Bcl-2家族蛋白

CST#5023 #3498

1. 确认样本表达量

2. Bcl-2家族的蛋白分子量都比较小，电泳建议选择15%的分离胶或梯度胶，溴酚蓝不必跑的太靠下

3. 转膜使用0.22μm孔径的膜，转膜条件建议为恒压70V转膜40-50min

4. Bax（促凋亡）与Bcl-2（抗凋亡）的蛋白表达变化一致是正常现象，可以通过比值来进行组间比较。若组间比较无差异，可以尝试其它凋亡信号通路

点击这里了解详情

TNF-α

CST#11948

1. 确认样本表达量，通常需要诱导刺激处理(如LPS)

2. 分泌蛋白，对于细胞样本，除诱导刺激处理外，还要使用BFA处理使得蛋白保留在裂解液中

3. 可能观察到多条带：18kDa的可溶形式和约25kDa的膜结合形式，另外还可能形成多聚体

4. 常用ELISA检测

锁定了关键的差异分子（例如，在外源性模型中FADD募集增加，内源性模型中Bax线粒体转位明显，或颗粒酶途径中检测到活跃的GrB及tBid），研究便进入了最核心也最迷人的环节——机制解析。这些分子是如何被特定诱导剂调控的？它们又是如何在各自途径中相互作用，最终汇聚到凋亡执行的？

第四步

解析机制—深入凋亡的“控制中心”

此阶段旨在阐明关键差异分子在凋亡通路中的具体作用、上下游调控关系及其分子机制。

明确上下游关系：

操控关键分子：过表达、敲低/敲除、抑制剂/激动剂

· 过表达：在模型中过表达目标分子（如外源性途径过表达FADD或Caspase-8，内源性途径过表达Bax或tBid，颗粒酶途径过表达GrB），观察是否加剧凋亡表型（如Annexin V+比例更高、Caspase激活更强）。

· 敲低/敲除：利用siRNA/shRNA敲低或CRISPR-Cas9敲除目标分子（如外源性敲低FADD或Caspase-8，内源性敲低Bax或敲除Bak，颗粒酶途径敲低GrB或靶细胞中的Bid），观察是否能抑制诱导剂触发的凋亡（抵抗凋亡）。反之，敲低抗凋亡分子（如Bcl-2）应能增强凋亡。

· 抑制剂/激动剂：使用特异性的小分子抑制剂（如外源性途径用Fas中和抗体或cFLIP过表达，内源性途径用Bcl-2抑制剂ABT-263或Mcl-1抑制剂，颗粒酶途径用GrB抑制剂Z-AAD-CMK，Caspase途径用Z-VAD-FMK）或激动剂（如Caspase激活剂PAC-1）干预目标分子的功能。

检测下游效应：操控关键分子后，必须回溯到第二步的表型检测！观察其对凋亡标志物（PS外翻、ΔΨm、Caspase活性、核碎裂等）的影响，验证其功能及在途径中的位置。

例如：

· 过表达tBid（内源性途径）后，应能检测到线粒体细胞色素C释放、Caspase-9活化增强。

· 敲低Bid（颗粒酶途径关键底物）应能抵抗GrB介导的凋亡。

· 使用Z-VAD-FMK应能阻断所有途径汇聚点的下游Caspase活化及凋亡执行。

探究作用机制：

相互作用验证：目标分子如何激活或抑制下游效应分子？

常用方法：

· 免疫共沉淀(Co-IP)：验证目标分子与上下游分子的直接或间接结合（如Bax与Bak的相互作用，Caspase-8与FADD的结合）。

· Pull-down (GST/His等)：验证直接结合，尤其适用于体外验证。

· 荧光共振能量转移(FRET)/双分子荧光互补(BiFC)：在活细胞内实时观察分子间相互作用及动态。

翻译后修饰研究：凋亡蛋白常受磷酸化、泛素化等修饰调控。

常用方法：

· 磷酸化特异性抗体(WB/IF)：检测关键位点的磷酸化状态变化。

· 去磷酸化酶/激酶抑制剂处理：结合表型检测，验证修饰的功能意义。

· 质谱分析：鉴定未知的修饰位点。

亚细胞定位变化：关键分子（如细胞色素C从线粒体释放到胞浆，Bax从胞浆转位到线粒体）的定位变化是重要的活化标志。

常用方法：

· 免疫荧光(IF) 结合特定细胞器标记物（如线粒体染料MitoTracker）是常用手段。注意优化固定通透条件，避免人为造成定位假象。

通路互作与动态验证：凋亡通路间存在交叉对话（如Caspase-8可切割Bid连接外源与内源通路）。

常用方法：

· 特异性通路抑制剂（如阻断死亡受体通路的Fas中和抗体，或阻断线粒体通路的Bcl-2抑制剂）结合表型检测，分析通路间的依赖关系。

· 时间动态监测：在诱导凋亡过程中，多点取样检测多个关键事件（如Caspase-8活化、Bid切割、细胞色素C释放、Caspase-3活化），绘制分子事件的先后顺序图谱。

研究凋亡信号通路，是一个从宏观表型到微观机制的递进过程。多指标联合验证（如形态学+生化检测+分子互作）、严谨的对照设置（阳性/阴性/处理/抑制剂对照）和时间动力学分析，是贯穿始终、避免误读的关键原则。

通过这条清晰的“造模-表型-差异-机制”研究路径，结合对检测技术的娴熟运用与问题洞察，您将能更自信地拨开凋亡信号网络的迷雾，揭示细胞生命抉择背后的精密调控逻辑。

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