在上一期文章中我们详细介绍了外泌体的分离纯化步骤。从本周开始，我们开始进入到外泌体的鉴定的实验解决方案。

鉴定维度：颗粒度，直径大小，密度，内含物，抗原表达，浓度等。

1 TEM/SEM 投射电镜/扫描电镜检测

双层囊膜结构是外泌体重要标志之一，但普通光学显微镜难以观察到此种亚显微结构。而透射电子显微镜 (Transmission electron microscope, TEM) 分辨率可达0.1 ~ 0.2 nm，可将被观察物体放大至数百万倍，非常适合进行外泌体双层囊膜超微结构观测。

（透射电子显微镜(TEM)(A)和低温TEM(B)原理的图解）

扫描电镜SEM是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观形态观察手段，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电 子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各 种效应，其中主要是样品的二次电子发射。它可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。此法的优点是分辨率可以<1 nm；大小和形态可以确定。缺点是不能分析异质外泌体群体，多分散样品成像条件苛刻，且通量低。

2 NTA纳米颗粒跟踪分析

纳米颗粒跟踪分析技术（简称：NTA），是近年来新兴的纳米级别测量技术之一，原理如下图所示。纳米颗粒在其悬浊液中受到周边溶液分子的撞击而做无规则的布朗运动，然后通过斯托克斯-爱因斯坦方程，这些颗粒在单位时间内 (ts) 的移动速度（2,y>）与其本身的粒度（dh）、溶液的粘度（Ƞ）和温度（T）存在数量上的关系。因此通过观察溶液中的颗粒运动轨迹，得出与之相关的颗粒粒径数据。同时，通过仪器内置的高速相机和软件，对观察到的每一个颗粒进行跟踪分析，最终提供与常规粒度仪所不同的粒径数量分布以及颗粒物浓度的分析结果。

通过纳米颗粒示踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,即 NTA)技术， 可以对10-2000nm范围内的纳米颗粒进行快速实时动态检测，测量 参数包括颗粒粒径、散射光强、浓度等，可对抽提获得的外泌体进行粒 径大小及数量进行统计，以及初步质量评估。该技术易用、快速、稳健、 准确,是对现有外泌体鉴定方法的一个良好补充。

3 DLS

DLS动态光散射，是一种测量外泌体大小的替代技术。DLS的工作原理是单色相干激光束通过颗粒悬浮液。然后观察到由样品中粒子的相对布朗运动引起的建设性和破坏性干涉引起的散射强度随时间的涨落。这种方法使用起来很简单，但不能将粒子形象化。这种方法的优点是它能够测量从1 nm到6µm大小的颗粒。它最适合于测量悬浮液(单分散悬浮液)中的颗粒。

外泌体是经由多泡体和细胞膜融合后释放到细胞外的囊泡小体，直径一般为 40-100nm，粒径小且容易受到破坏。传统技术上被用于表征微粒大小的方法有流式细胞技术法，动态光散射（DLS），电子显微镜检查法（TEM/SEM）等。

在这之中又以流式细胞技术法应用最为广泛，实际上流式细胞仪的粒度下限约为 300nm 左右，虽然我们通过荧光标记可以扩展该检测限值，但粒度较小时，准确测定这类颗粒大小的能力严重受限。DLS 跟NTA的主要区别在于浓度范围，当浓度过低时，NTA 可以非常圆满的完成检测任务，而 DLS 只能检测浓度较高的样品。

4 WB电泳

通过提取外泌体总蛋白，用Western Blot方法对目的蛋白进行相对定 量，了解其在外泌体中的富集情况，或通过特有外泌体标志物的 Western Blot鉴定说明样本为外泌体。WB鉴定外泌体常见marker：CD63/ CD81/ CD9/ TGS101/ HSP70 等

Western blot showing CD81 and CD63 blotting on K562 EV lysate (7 μg) and cell lysate (86 μg)

5 外泌体示踪

外泌体是细胞分泌的微小膜泡，具有双层膜结构。PKH67荧光染料可以稳定的与膜脂质区结合并发出绿色荧光。PKH67荧光染料标记外泌体之后，与受体细胞共培养，进而可以示踪细胞摄取外泌体。

6 AFM: Atomic force microscopy原子力显微镜

原子力显微镜是1986年由BINNIG等[33]开发的，并提供亚纳米分辨率地形成像。原子力显微镜由末端具有尖锐尖端的悬臂梁组成，与其扫描样品 表面没有物理接触，测量尖端的运动，并通过软件创建 三维图像。

由于横向分辨率为3 nm，垂直分辨率<0.1 nm ， 原子力显微镜适用于尺寸大小的检测，在多分散样品上 的性能比动态光散射好。SIEDLECKI等和YUANA 等表明原子力显微镜可以用来测量外泌体在生理状态 下的相对尺寸大小。由于原子力显微镜的分辨率高，外泌体必须结合到非常平坦的表面，例如云母，抗体可与 外泌体表面结合，从而获得生物化学信息。因为用抗 体结合外泌体的表面效率是未知的，所以不能确定外泌体的浓度。此外，表面结合可能影响外泌体的形态，可能会影响实际直径。此方法的优点在于适用于尺寸测定， 在多分散样品上性能比动态光散射好，灵敏度高，样品制备简单且快速；缺点在于吞吐量低且价格较昂贵。

(A)原子力显微镜示意图；(B)通过分析扫描地形图像得到的HPC-4细胞系的EVs分布

7 流式细胞术

不同来源的外泌体会带有特有的表面分子marker,该特性 与外泌体的靶向运输有重要关联。通过与珠子绑定的方式, 用流式细胞仪分析样品中不同来源的外泌体比例，或检测不同样本分泌外泌体量的差异。

外泌体粒径太小，折射率低，低于常规流式细胞仪分析的阈值，因此不能准确区分粒子与噪声。

采用常规的流式细胞仪进行检测时往往需要将外泌体与微珠连接以增大表面积、增强反射，或者加入纳米金颗粒来增加外泌体粒径之后再检测。

通过结合EV与Beads结合检测EV和EV相关的表面分子。

要用传统的流式细胞计来分析EV，通常需要将EV结合到足够大到可以在流式细胞计上识别到的Beads上。

外泌体流式检测实验workflow如下：

实验案例流式结果图展示（我们会在下期文章中分享流式实验操作的详细protocol，敬请期待！）

Example analysis of epitope detection EVs by binding to beads.

EVs isolated from DC2.4 and 4T1 cell cultures (dark grey histograms), as well as control EV-depleted medium (light grey histograms), were incubated with anti-CD9 coated magnetic beads overnight, and subsequently labeled with anti-CD9-FITC antibodies. The same clone of anti-CD9 was used for capture and detection, to ensure EV-anchored CD9 detection and not free (soluble) CD9 detection, if any. Open histograms with (asterisk) correspond to FITC-CD9 staining profile on the surface of EVs from DC2.4 and 4T1 cell lines, while the other histograms represent isotype and nonspecific binding controls

8 实验方法总结

外泌体不同鉴定实验方法的比较：

参考文献：

1 Flow Cytometric Analysis of Extracellular VesiclesDOI 10.1007/978-1-4939-6728-5_16,

2 Optimisation of imaging flow cytometry for the analysis of single extracellular vesicles by

using fluorescence-tagged vesicles as biological reference material

DOI:10.1080/20013078.2019.1587567

3 Methods for the physical characterization and quantification of extracellular vesicles in biological samples

4 Characterizing Extracellular Vesicles and Their Diverse RNA Contents

doi: 10.3389/fgene.2020.00700

5 The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization

doi:10.3390/ijms18061153

6 Methods and Technologies for Exosome Isolation and Characterization

DOI: 10.1002/smtd.201800021

7 Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy

DOI: org/0957-0233/28/3/034006)

8 MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments

DOI: 10.1080/20013078.2020.1713526

9 Imaging of extracellular vesicles derived from human bone marrow mesenchymal stem cells using fluorescent and magnetic labels

DOI:org/10.2147/IJN.S159404

10 间充质干细胞源性外泌体的检测方法

DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2063