此流程描述了从未裂解的全血中制备新鲜或固定的、未刺激或体外激活的血小板;血小板的染色以及FACS流式细胞仪采集血小板数据的过程。当检测体内血小板激活或分析体外血小板激活的试验时，至关重要的是在血液采集和样品处理过程中尽量减少对血小板的人工刺激。即使精心准备，也很难避免低水平的无意血小板激活。因此，按理说未受刺激的血小板应始终与体外受刺激的样本并行分析，以衡量具体效果。当使用流式细胞术进行血小板测定时，抗凝、采血、固定、激动剂和圈门、分析策略是独立变量;唯一的限制因素是抗体。这里概述了一些指导方针。

1. ACD真空采血管(BD Cat. No. 4816).

2. Falcon 一次性 12 x 75 毫米带盖聚苯乙烯试管(BD Cat. No. 2058).

3. 移液器(BD Electronic Pipette, BD Cat. No. 343246) .

4. 二磷酸腺苷(ADP)， 2 x 10-4 M (Bio/Data, Inc, Phila, PA, Cat. No.101312)。根据制造商的说明书进行准备。储存在2°至8°C。

5. 在含有 0.1% 叠氮化钠的 PBS 中制备 1% 多聚甲醛溶液。在 2° 至 8°C 的棕色玻璃瓶中储存最多 1 周。

警告1:吸入、皮肤接触和吞食甲醛是有害的。它对眼睛和皮肤有刺激性。皮肤接触可引起过敏，甚至会导致癌症，可能有不可逆影响的风险。请上锁并放在儿童接触不到的地方，远离食物、饮料和动物饲料。穿戴合适的防护服和手套。如不慎吞食，应立即求医，并出示容器或标签。根据联邦、州和地方法规处理。

警告2:叠氮化钠如果吞食是有害的。请放在儿童接触不到的地方，远离食物、饮料和动物饲料。穿合适的防护服。如不慎吞食，请立即就医并出示此容器或标签。叠氮化物与酸接触释放出剧毒气体，在处理过程中应该用大量的水冲洗，以避免在铅或铜管道中发生沉积引发爆炸。

6. 离心机

7. 洗涤缓冲液：含 0.1% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（不含钙、镁或酚红的 Dulbecco PBS，pH 7.2 ± 0.2）。使用前通过 0.2-μm 过滤器过滤 PBS；储存在 2° 至 8°C。

8. 涡旋混匀

9. 染色缓冲液:含0.1%叠氮化钠和2%胎牛血清的PBS。储存在2°至8°C。

10. BD 荧光染料偶联的人血小板抗原单克隆抗体。有关更多信息，请参阅相应的试剂包装说明书。

11. Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) (Sigma Cat. No. A9041)。在PBS中准备10 mg/mL。使用带有偶联PAC-1抗体的RGDS。注意:一些商业制剂可能包括脂多糖(LPS，一种有效的血小板激活剂）。

12. FACS流式细胞仪。详细信息请参阅相应的仪器使用指南。

13. CaliBRITE 校准微球。有关详细信息，请参阅 BD CaliBRITE Beads 包装说明书。

14. 用于仪器设置的 FACSComp 软件和用于采集和分析的 CellQuest 软件。有关详细信息，请参阅相应的软件用户指南。

我们的实验室已经成功地使用了ACD、柠檬酸钠和EDTA抗凝剂。然而，其他抗凝剂也可以起作用。肝素抗凝剂可激活血小板，不推荐用于测定体内血小板活化。注: PAC-1 与纤维蛋白原受体的结合对 pH 和 Ca2+ 敏感。PAC-1 不会与 EDTA 处理的血液结合，而且 PAC-1 在柠檬酸钠中的结合率通常高于 ACD。以下方案旨在尽量减少采血过程中血小板的人为激活。

1. 标记收集管并将它们放置在同一个管架上。

2. 用20号针头，无菌静脉穿刺，收集约2ml血液到任何类型的真空管中。扔掉这些血液，因为里面含有活化的血小板。释放止血带，将血液收集到有标记的ACD真空管中。这些血用来染色。在采血后10分钟内激活、染色或固定血小板。

此过程是可用于激活血小板的各种方法的一个示例。我们的研究实验室已成功使用 ADP、肾上腺素、佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 (PMA)、凝血酶和凝血酶受体激动剂肽 (TRAP)。

1. 采血10分钟内，用移液管将50 μL ADP溶液移至12 × 75毫米的试管中。

2. 加入0.45 mL全血。轻轻地旋转搅拌。

3. 室温(20°C至25°C)孵育2分钟。

4. 立即染色或固定。

染色前用多聚甲醛固定血液可抑制血小板自发激活。在临床试验中，固定血小板可以使试验更易于操作。固定对激活依赖的血小板抗体有影响。PAC-1 不会与多聚甲醛固定的血小板结合，CD62P 结合会降低。如果不需要或不可能进行固定，请继续下一部分，直接免疫荧光染色，并使用新鲜的全血。

1. 在采血10分钟内，将100 μL未刺激或激活的全血移液管放入12 × 75毫米的试管中，试管中含有1 mL的冷(2°C至8°C) 1%多聚甲醛溶液。注:100 μL全血可产生足够20次试验的固定血。如果需要额外的固定血，准备适当数量的导管。不要增加管内血液或多聚甲醛的体积，因为这会增加血小板聚集的可能性。

2. 将血小板固定在2°C至8°C至少2小时。固定血小板可以稳定5天。储存在2°至8°C。

3. 染色前，固定血在室温(20°~ 25°C)下1200 × g离心5分钟。

4. 去除上清液，加入1ml室温洗涤缓冲液。

5. 通过涡旋重悬沉淀。在室温下以 1200 x g 离心 5 分钟。

6. 取出上清液并将沉淀重悬在 1 mL 的室温染色缓冲液中。

单色或多色染色可用于测定。通过多色染色，一种抗体偶联物可用于阈值数据采集，以仅分析那些与活化无关的血小板特异性抗体（例如 CD61 或 CD42a）结合的血细胞。与不同荧光染料结合的另一种抗体可用于同时评估与血小板相关的活化依赖性抗体的结合，例如 CD62P 或 PAC-1。CD61、CD62P 和 PAC-1 试剂的组合代表了一种三色检测，可报告血小板活化的两个方面。 以下是多色染色程序。

1. 标签:12 × 75mm软管。

2. 向对应标记的试管中加入适当体积的不依赖于活化的血小板特异性抗体。

3. 将适当体积的同型对照或血小板活化依赖性单克隆抗体添加到对应标记的试管中。测试和对照抗体浓度应匹配。查阅每个测试抗体的单克隆抗体数据表以确定要使用的对照量（以微克为单位）。注:为了证明PAC-1的特异性结合，在染色混合物中包括一管10 μL RGDS溶液。RGDS肽竞争性地抑制PAC-1的结合。请参阅PAC-1数据表。

4. 每次使用一个新的移液枪头，小心地在每根管的底部添加以下任一:

1）采血10分钟内取5 μL未刺激或激活的新鲜全血

2）50 μL无刺激或激活的全血悬液固定5天

小心操作，防止血液从管子的一侧流下。如果血液留在管的一侧，它可能没有被试剂染色。如果发生这种情况，请放弃并重试。

5. 轻轻地旋转管子混合溶液。

6. 室温避光培养15 - 20分钟。

7. 向每个管子中加入 1 mL 冷（2° 至 8°C）1% 多聚甲醛溶液并涡旋混匀。将染色和固定的细胞在 2° 至 8°C 下避光储存至少 30 分钟，但不超过 24 小时。在流式细胞仪上分析样品。

可以对散射门控或荧光门控进行采集和分析。当血小板计数较低或样品中存在聚集时，散射门控(正向散射[FSC]和侧散射[SSC]的门控)可能很困难。在正常和疾病状态下，特别是在被激活时，血小板和红细胞会有重叠的光散射特征。对于散射门控，通过设置适当的FSC阈值来排除碎片和背景噪声。可以对激活无关的血小板标志物进行荧光门控(对FL3和SSC的门控)，然后可以独立分析阳性人群的光散射谱。静脉血通常显示三种粒子亚群。大多数颗粒由单个完整的血小板组成。第二个群体，通常代表所有颗粒的 5%，表现出比单个血小板更大的光散射，并代表与大白细胞 (WBC) 相关的血小板。第三个群体，占光散射低于单个完整血小板的颗粒的 5% 至 15%，包括平均直径为 0.1 μm 的血小板衍生微粒。

对于荧光门控，通过设置适当的 FL3 阈值来排除碎片和背景噪音。FACS 流式细胞仪应使用 FACSComp 软件和 CaliBRITE 微球进行校准。裂解/免洗设置可用于血小板。然而，由于血小板比白细胞小得多，因此事件并未沿每个轴最佳显示。以下程序使用荧光门控和最佳显示血小板事件的设置。

1. 为 FSC 和 SSC 增益选择对数放大。

2. 将流速率设置为低，以减少同时发生的事件。

3. 使用与 FL3 偶联物结合的不依赖激活的血小板特异性抗体触发阳性事件的采集。

4. 使用染色有同型对照的血小板或染色有活化依赖性单克隆抗体的未刺激血小板来调整 FL1 和 FL2 PMT 电压。在FL1和FL2点图中，FL1/FL2基线信号早在前10年被准确描述。对于PAC-1，使用PAC-1和RGDS染色的静息血小板。

5. 使用在 FL3 中用活化非依赖性血小板特异性抗体偶联物染色的活化血小板以及活化依赖性抗体和同型对照的混合物来调节补偿。例如，使用 PAC-1 FITC/小鼠 IgG1 PE/CD61 PerCP 染色的血小板来调节 FL2 的 FITC 补偿。要在使用 PAC-1 FITC 时调节来自 FL1 的 PE 补偿，请在存在 RGDS 的情况下用 PAC-1 FITC/CD62P PE/CD61 PerCP 染色以抑制 PAC-1 结合。

6. 收集5,000至10,000个非激活血小板事件。

7. 将总血小板群（包括与 WBC 相关的血小板群或任何光散射门控亚群）显示为双色点图并进行统计分析。