类器官是一种器官特异性类型的3D细胞集合，通常来自干细胞(多能、胎儿或成人)，并能以与体内相似的方式经细胞分序(cell sorting out) 和空间限制性的系别分化而实现自我组建，模拟器官的关键功能、结构和生物学复杂性。与传统的2D培养和动物模型相比，类器官培养使患者在模型中具有特异性，同时在体外重现体内组织样结构和功能。与动物模型相比，类器官更便于操作和深入的生物学研究。因此，类器官培养已被广泛应用，包括药物发现及筛选、个性化伴随诊断、再生医学和细胞治疗等方面中。

自2009年首个小肠类器官被成功构建以来，随着研究的不断深入，越来越多的类器官被成功构建和培养，其中包括肠，胃，胰腺，肝脏，肺脏，肾脏，大脑，心脏等等。近几年，类器官的热度高居不下，也是国自然热点的重点关注对象。今天小优就用两篇2023年最新发表的综述文章，带大家一起了解类器官在癌症和肿瘤免疫研究中的新进展。

类器官相关文章数量趋势（数据来源：PubMed）

癌症模型中的类器官培养

ASC和PSC类器官构建的机理和步骤有很大差别。ASC类器官是从原生组织中获得的细胞悬液中，这些细胞悬液嵌入细胞外基质中，并在特定生长因子的存在下生长，以指导细胞分化。这些生长因子模拟了正常干细胞存在的因子。PSC类器官通常是从2D培养的干细胞培养而来的，这些干细胞成熟成球体，使用激活素A致力于内胚层，然后在3D培养中使用特定的分化信号，这取决于最终所需的组织类型。通过在胚胎发育过程中模拟细胞信号的顺序添加生长因子来逐步分化。这两种方式构建的癌症模型也有不同的优点和缺点，在为研究选择合适的模型时应该考虑这些因素。尽管如此，ASC和PSC类器官也可以相互补充，它们一起提供了研究几乎所有人类癌症肿瘤进展。

ASC和PSC来源的类器官培养步骤

癌症模型的类器官培养

表1：ASC和PSC来源的癌症类器官模型的比较

2009年，一项里程碑式的研究表明，可以从小鼠Lgr5+肠道ASC建立3D肠道类器官。细胞在基质胶中生长并长期培养，补充干细胞niche-调节因子(noggin、R-pondin1和表皮生长因子[EGF])。与此同时，另一个小组开发了另一种培养肠道类器官的方法：气液界面(ALI)模型，该模型包括在部分暴露在空气中的胶原基质中培养含有上皮细胞和间充质细胞的小鼠肠道组织片段。

自从这两项突破性的研究以来，已经成功建立了从一系列正常组织及其相应的癌症组织ASC来源的类器官。随着步骤和方案的改进也提高了类器官构建的效率，使从小的活体组织检查、尿液、宫颈涂片甚至循环肿瘤细胞(CTC)中建立肿瘤类器官成为可能。

已经成功建立的人癌症的类器官模型

目前多篇文献都已经对建立癌症类器官的方案进行了详细总结（具体文献可以查看原文参考文献12–18,20,23,26,29,30,31,33–44,46,49,54,69–77），下图总结了正常和肿瘤类器官培养的培养条件。针对每种癌症类型需要不同的优化方案，以避免正常的细胞污染和提高了癌症干细胞的活性。尽管如此，混合物中的正常类器官也可能会击败肿瘤类器官，并最终在培养中占据主导地位，特别是在培养条件不能特别有利于肿瘤细胞的情况下。因此，通过全外显子组测序(WES)或靶标捕获panel测序来验证肿瘤纯度是必不可少的。

减轻正常细胞污染和提高效率的策略包括：

(1) 去除一些癌症中由于普遍存在的原癌基因突变而不再需要的niche因子：例如，不添加Wnt3a和R-pondin1极大地促进了结直肠癌(CRC)类器官的形成，而不添加EGF在构建胰腺导管腺癌(PDAC)类器官时有很好的效果。

(2) 调整样品的获取方式：例如，沿着胃肠道的浆膜侧取样可以提高肿瘤的纯度，在传代过程中手动挑选肿瘤类器官可以帮助消除正常细胞的污染。

(3) 调整培养条件：例如，培养横纹肌样肿瘤类器官时，在细胞分离过程中加入Y-27632，培养子宫内膜癌类器官时去除p38抑制剂，也可以提高肿瘤类器官的活力。使用无血清、Afamin-稳定的Wnt3a可以稳定培养PDAC器官，因为标准Wnt3a特殊培养基中的血清会触发胰腺类器官的细胞衰老。

(4) 使用条件性重编程技术(conditional reprogramming，CR)：该技术指在Rho激酶抑制剂(Y-27632)存在下，将辐照小鼠成纤维细胞饲养细胞与正常和肿瘤人上皮细胞共培养[1-2]。

正常和肿瘤类器官培养条件

此外，文章中也介绍了ASC癌症类器官在基因和表型的关联性，保存组织谱系多样性，细胞可塑性，细胞状态转变，保留原发肿瘤的肿瘤内异质性和亚克隆结构的能力等重要和独特的特性。

结肠类器官的类型，从正常到肿瘤前病变及其应用

类器官也可以由胚胎或者诱导的PSCs产生。直接使用人类胚胎干细胞受到伦理法规的约束，相比之下，iPSCs涉及将体细胞重新编程为多能性。第一步是将iPSCs定向分化为三个胚层(内胚层、外胚层和中胚层)，然后在含有特定生长和信号因子的3D基质中培养细胞，以引导它们发展成为所需要的类器官。这个模型的一个主要挑战是需要在体外确保这些驱动细胞分化和类器官形成的生化信号可以在正确的时间、位置和浓度忠实地模拟所有体内的过程。PSC来源的类器官最初通过使用激活素A处理人PSCs以促进内皮识别，然后与FGF4和WNT3a共同孵育以促进后肠形成。这一方案最终产生了表达特定肠道标志物如CDX2和KLF5的肠道类器官。之后，PSC来源的类器官技术被广泛用于疾病建模。到目前为止，已经成功地创建了许多PSC来源的类器官，包括脑、胃、肺、胰腺、食道、肾脏、肝脏等等。这些模型对于干细胞生物学和类器官发育产生了重要的影响。

然而，使用PSC来源的类器官进行癌症研究的一个挑战是，它们缺乏ASC类器官直接从肿瘤组织中获得的癌症基因突变。为了绕过这个问题，人们试图直接将癌细胞重新编程为PSCs，以了解肿瘤的过程。然而，取得成功的成果相对较少，其中大部分主要涉及血液癌症，包括来源于急性髓系白血病、慢性髓系白血病、幼年性粒单核细胞白血病等。有趣的是，尽管具有相同的遗传异常，来自白血病细胞的iPSCs缺乏致白血病能力。然而，当它们被诱导分化为造血干细胞时，它们的白血病表型重新出现。这种方法提供了一个研究病人间特异性突变和疾病表型之间关系的机会。或者，另一种策略是将致癌基因突变导入PSC细胞，然后诱导分化为特定器官，以建立胰腺、肺、胃、视网膜和脑等类器官模型。这种方法在从PSCs构建脑类器官已经取得成功，CRISPR-Cas9编辑被使用来设计可以在脑肿瘤中观察到的一系列最常见的单一和组合突变的脑类器官。此外，将来自癌症易感综合征患者的正常体细胞重新编程为PSCs，用于模拟来自生殖系APC、GNAS或BRCA1突变患者的各种类型的癌症。

与动物模型相比，体外模型的一个优势是它们对高通量药物敏感性筛查的适应性。具体地说，几十年来，癌细胞系一直被用来在体内模型中应用之前评估药物疗效。癌症患者来源的类器官也可以用于大规模的药物筛选。例如：一项使用患者来源的CRC类器官的研究表明，Cetuximab和Nutlin-3a对KRAS和TP53野生型癌症类器官的生长抑制作用有效。许多其他药物筛选试验已经在癌症类器官中进行，包括乳腺，膀胱，头颈部鳞状细胞，肝脏，卵巢，胰腺，前列腺，胃等多个癌症类器官。最近对方案的改进使得能够对正常、前体和肿瘤类器官进行筛查；提高了可扩展性；并将读数从细胞活性分析扩大到基于图像的高含量表型。

此外，除了使用癌症类器官来确认已知的基因联系外，类器官模型也可以预测标准治疗的临床反应。类器官反映了对化疗治疗的逐渐获得抗药性。除了预测药物反应外，类器官也可以预测化疗放射治疗反应的潜力。

基于类器官的药物筛选的另一个目标是识别新的治疗靶点。对不同类器官的初步药物筛选研究已经产生了令人鼓舞的数据，为癌症患者提供治疗策略。例如，在细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂(SCH772984)的治疗下，一部分原发性肝癌类器官显示出生长抑制，但它们对大多数其他临床相关化合物具有抗药性，结果在异种移植小鼠中得到验证。

虽然PDX模型被认为是体内肿瘤的良好代表，但它们昂贵，移植成功率低，需要较长的培养时间。病人来源的类器官移植瘤模型可以作为更好的解决方案。最简单的方法包括皮下注射健康的、癌症的或转基因的类器官与Matrigel共同注射到小鼠的腹部，这种方法不需要高级手术技能就可以执行，并且读数很容易观察到。然而，皮下器官移植的植入率很低，不能重现自然的肿瘤微环境，因为缺乏血管系统阻碍了肿瘤生长所需的niche因子的供应。为了解决这个问题，科学家们将癌症/工程的类器官注射到裸鼠的肾包膜下或脾中，这两个都是高度血管的环境，确保了移植的类器官有充足的营养、激素、生长因子和氧气供应，大大提高了植入率。移植的细胞可以直接进入血流并转移到肝脏，在那里进行继发性病变扩散，成为研究人类肿瘤肝转移的理想平台。

类器官：构建了基础研究和临床实践之间的桥梁

类器官与比其他模型系统具有不可替代的优势。二维(2D)细胞模型在肿瘤发生发展的分子机制研究中占有重要地位。但与3D类器官模型相比，2D细胞系模型在体外维持细胞极性、捕捉肿瘤-间质或细胞-细胞的空间相互作用、捕捉肿瘤细胞与周围基质或肿瘤微环境的动态相互作用以及探索性方面表现较差，这极大地限制了其在肿瘤研究中的应用。

类器官在很大程度上反映了原始组织的各种特征。在肿瘤生物学行为(如表型和遗传稳定性)和药物敏感性方面，类器官与原发组织高度一致。例如，人类多能干细胞(HPSC)来源的视网膜类器官在单细胞转录组学中显示出人类胚胎视网膜细胞成分的高度一致性。与PDX模型相比，类器官模型的优势主要体现在其高通量药物筛选潜力和较强的基因编辑适用性。利用新兴的微流控技术，肿瘤类器官对各种药物组合的治疗反应可以在不同的浓度梯度下完全捕获，同时大大减少了所需试剂的剂量，这极大地增强了药物筛选平台帮助优化临床决策的能力。综上所述，通过结合高通量药物筛选、基因编辑或标记和成像技术等，类器官技术无疑将为恶性肿瘤的多维分析开辟一条有前途的途径。

类器官在基础领域和临床应用中的广泛应用

类器官模型和其他模型的对比

类器官可以帮助研究肿瘤发生的每一步中的关键分子变化，表征特定的分子亚型，并探索肿瘤生物学行为的潜在机制。越来越多的研究表明，类器官平台可以有效地捕获和识别恶性肿瘤的特定亚型(如乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌)的生物学驱动因素，这可能极大地促进个性化医疗的发展。Artegiani等将胆管癌的四种常见突变(TP53、SMAD4、NF1和PTEN)引入人肝脏类器官，发现只有其中一种突变的类器官仍具有与野生型组织相似的正常囊泡形态。值得注意的是，当BAP1共突变增加时，类器官表现出胆管癌不同的恶性表型，如不规则的细胞形态(印痕细胞/多态核)、细胞极性受损、细胞活力增加、上皮结构破坏和更高水平的胶原纤维沉积破坏，这些可以通过恢复BAP1的表达来逆转。

此外，肿瘤类器官可以准确地概括原始异质性，从而便于识别各种肿瘤的主要亚型，如卵巢癌、肾细胞癌、三阴性乳腺癌等。类器官在肿瘤的增殖、侵袭、转移和耐药等生物学行为中也起着关键作用。

通过CRISPR-Cas9系统，我们可以通过在正常组织中引入任意基因改变组合来设计肿瘤类器官模型。越来越多的临床试验提出对类器官进行功能基因筛选，以发现在肿瘤进化、进展和耐药等肿瘤生物学行为中起主导作用的候选基因或潜在治疗靶点。类器官功能遗传筛选作为干细胞研究和新治疗靶点筛选的一种优秀方法，在探索生物过程、阐明疾病机制、解释遗传元件功能等方面取得了显著进展。

考虑到单细胞测序技术的重大突破，类器官平台和多组学的合作可能为进一步阐明和解释疾病生物学和肿瘤进展开辟新的途径。在此，我们从单细胞转录组学、蛋白质组学、表观基因组学、代谢组学四个维度总结和阐述了类器官平台在揭示恶性肿瘤的高异质性、癌变、肿瘤演化、耐药性和潜在治疗靶点方面的创新作用和巨大潜力。类器官平台在蛋白质组学和代谢组学中的应用也开始受到广泛关注，它可以在翻译水平上为我们了解疾病生物学过程背后的机制提供独特的视角。