我们在做药物功能性分析实验中，经常会检测细胞分泌的因子或胞内标志物变化，如：细胞因子TNFα等，磷酸化-ERK等。例如：细胞分泌的增加可能是由药物的细胞毒性效应导致细胞膜破坏。相反，标志物释放的变化可以通过细胞失去生存能力的防御机制间接触发。
所以，评估细胞活力对分泌标志物的定量和胞内标志物变化评估是非常重要的，以确保释放目标浓度的调节不是由被测试化合物对细胞活力的影响引起的，特别是在长期处理（>2小时）的情况下。
为验证上述想法，作者进行了如下实验。实验设计为A和B两个检测方案：（参考图1）。
方案A包括在单独的孔/板中检测标记物和ATP，如：磷酸化蛋白+总蛋白+管家蛋白+ ATP）。然后将5µL的细胞裂解液转移到第一个检测板中，并加入25µL的ATPlite 1 Step裂解和检测试剂来测量细胞活力。在第二检测板中，依次分配适当体积的相同细胞裂解液并添加相应的Alpha或HTRF检测试剂来检测标志物的水平。
方案B是基于在同一孔检测标记物和ATP，并对每个分析物进行顺序检测。将适当体积的细胞裂解液转移到检测板中，并添加Alpha或HTRF检测试剂检测。孵育后（总孵育时间不能超过4小时以避免ATP降解）放入酶标仪检测。读值结束后，加入5µL ATPlite 1 Step检测试剂（试剂浓度比说明书参考浓度高2.5倍）来测量ATP的量。在适当的混合/孵育平板后，在兼容的酶标仪上读取发光值。
图1：方案 A和B实验方案设计
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实验方法
A-431细胞置于96孔细胞培养板中，密度不高于5000个细胞/孔，完全培养基（DMEM with GlutaMAX™ 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% Non-Essential Amino Acids, and 2 mM HEPES）。MCF7细胞以25000个细胞/孔铺于96孔细胞培养板中，完全培养基（MEM alpha medium supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% Non-Essential Amino Acids, and 2 mM HEPES）。在37°C，5%二氧化碳下孵育过夜后，用增加剂量的PD98059（在添加0.1%DMSO的完全培养基中制备）处理细胞，在37°C，5%二氧化碳下再孵育过夜。弃培养基，A-431细胞使用Alpha裂解缓冲液（1X），MCF7细胞使用HTRF磷总蛋白裂解缓冲液#1进行裂解，磷酸酶抑制剂由试剂盒提供。
方案A所有Alpha实验在2.5小时（添加受体混合物后1小时和添加供体混合物后孵育1.5小时）后读取。HTRF检测方法均在过夜孵育后读取。
方案B在总孵育2.5h（加入受体混合物后1h和加入供体混合物后1.5h孵育后）读取Alpha数据。在孵育4小时后，读取HTRF磷酸化ERK1/2。
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数据分析
(1)
AlphaLISA磷酸化检测和ATPlite 1step分析检测数据（A-431细胞）
方案A得到的结果所示。PD98059对细胞的处理诱导了ERK1/2在Thr202/Tyr204处的磷酸化水平呈剂量依赖性下降（蓝色曲线），半抑制浓度值接近2µM，这与文献一致。总ERK1/2的水平保持稳定，在最高剂量的化合物中，其信号下降了约30%（红点）。ATPlite 1 Step信号（橙色点）遵循相同的趋势，在PD98059的10µM处信号损失45%，表明在此条件下出现细胞毒性效应。然而，无论化合物的剂量如何（绿点），管家蛋白GAPDH的水平都没有变化，这意味着总ERK1/2和细胞活力的下降不是源于细胞脱离。如图2（A&B）。
方案B获得的数据与方案A对Phospho-ERK1/2和细胞活力的数据获得的结果相似。因此，Alpha检测技术和ATPlite 1 Step分析可以在同一孔中连续检测，没有任何干扰。如图2（C&D）。
图2：AlphaLISA磷酸化&ATPlite 1 Step方案A和B结果展示
(2)
HTRF磷酸化检测和ATPlite 1step分析检测数据（MCF7细胞）
方案A MCF7细胞处理PD98059显示剂量依赖的磷酸化水平ERK1/2Thr202/Tyr204（蓝色曲线），半抑制浓度值IC50接近1µM。总ERK1/2的水平是稳定的，仅在化合物的最高浓度（红色点）时，才观察到的信号损失约为30%。然而，在两种最高剂量的PD98059时，ATP含量（橙色点）和GAPDH水平（绿色点）均显著下降，在10µM时最大下降55%。这些数据表明，MCF7细胞比A-431细胞受到处理的影响更大。除了诱导更高的细胞活力损失外，该化合物还诱导了该细胞系的细胞分离，如GAPDH信号下降。如图3（A&B）。
方案B获得的数据与格式A对Phospho-ERK1/2和细胞活力获得的数据相似，表明HTRF和ATPlite1步骤检测也可以在同一井中连续检测，没有任何干扰。如图3（C&D）
图3：HTRF磷酸化&ATPlite 1 Step方案A和B结果展示
研究证明：对细胞活力检测可以完整地了解化合物的作用机制和相关的潜在副作用。可以免疫分析（如细胞因子释放TNFα等或磷酸化水平phospho-ERK等）的补充，非常适合确定药物化合物从有效性到安全性评价。
来源于优宁维药物研发官网
