使用细胞器选择性染色剂或染料让细胞器显色是细胞和组织荧光成像的关键。这些特异性染色剂适合用作抗体复染剂，帮助识别细胞内特定位置的目标靶点。除了固定细胞的研究外，对活细胞的研究可以更好的了解细胞内生命活动的状态及其变化，其难点在于活细胞细胞膜的选择透过性，会阻止外界物质的进出，因此选择合适的荧光染料至关重要。
本文主要针对以下几个常见的亚细胞架构：细胞骨架、线粒体、内质网、高尔基体、细胞核、溶酶体、细胞膜，为大家介绍如何在活细胞或固定细胞中选择合适的试剂/探针分别对它们进行染色。
细胞骨架
1.1
肌动蛋白
1.1（a）
活细胞肌动蛋白染色
对于活细胞中的肌动蛋白染色，可以通过带有荧光染料的肌动蛋白，或带有GFP标记的肌动蛋白来进行染色。虽然荧光肌动蛋白能够最准确的定位出靶点肌动蛋白的结构，但对于某些细胞（如原代细胞），通过显微注射或蛋白质转染试剂的手段，较难实现将荧光肌动蛋白引入目标细胞中。此时最好的方式是使用低细胞毒性、高特异性、可通过活细胞的细胞呈象探针（SIR-actin™）
《Natural Method》中，就描述了如何利用这种探针来进行细胞骨架结构的活细胞呈象，如图2所示。同时，其中还就染色探针在长期成像浓度下对细胞的毒性进行了研究，结果表明在24小时内，SiR -tubulin和SiR -actin对原代人成纤维细胞都没有表现出明显的细胞毒性。
图1. 结构化照明显微镜(Structured illumination microscopy，SIM)下，使用SIR -tubulin(左)或SIR -actin(右)染色的人成纤维细胞。
图2. 对SiR-tubulin（上）和SiR-actin（下）荧光染色探针毒性测试结果。白色亮点代表代表没办法继续进行有丝分裂或由于细胞骨架的改变无法在表面继续生长的细胞。
1.1（b）
固定细胞肌动蛋白染色
最常见的固定细胞中肌动蛋白染色剂是鬼笔环肽偶联物（phalloidins）。带正电或负电的荧光染料会通过非特异性的离子相互作用与其他蛋白质结合，导致产生更高的背景；Actin-stain系列的鬼笔环肽荧光探针是非离子型的，因此更有助于获得理想的低背景结果。
图3. 在Swiss3TS细胞中，使用 anti-vinculin（红色）进行，Dapi进行核染(蓝色)，用Actin -stain™488 Phalloidin (# PHDG1, Cytoskeleton对F-actin进行染色(绿色)
下表对几种鬼笔环肽荧光染料的生物特性（染色亮度、光漂白稳定性、背景强度、亲和力等）进行了对比：
|
偶联物 |
亮度 |
光漂白稳定性 |
背景强度 |
亲和力 |
货号 |
|
Fluorescein-phalloidin |
432 |
6 |
22 |
72 +/-12 |
na |
|
Acti-stain™ 488 |
832 |
57 |
5 |
55 +/-8 |
|
|
Acti-stain™ 535 |
430 |
27 |
12 |
36 +/-7 |
|
|
Acti-stain™ 555 |
551 |
46 |
16 |
63 +/-8 |
|
|
Acti-stain™ 670 |
332 |
8 |
18 |
50 +/-12 |
|
*= AFU's measured by quantitative cell imaging.
**=Measured in stained Swiss 3T3 cells in the absence of antifade.
若实验中使用到甲醛进行固定或透化，甲醛会破坏鬼笔环肽的天然结构，因此可以考虑使用免疫荧光法对固定细胞中的肌动蛋白进行染色。如今被发现的肌动蛋白亚型总共有6种，包括α-actin （ACTA1）、平滑肌α-actin（ACTA2）、细胞质β-actin（ACTB）、心肌α-actin（ACTC1）、细胞质γ-actin（ACTG1）、平滑肌γ-actin（ACTG2/ACTA3）。针对不同亚型的肌动蛋白，可以选择不同的特异性一抗，如下表所示：
|
货号 |
产品 |
抗体特异性 |
|
|
Anti pan-actin antibody |
All isoforms of actin |
|
|
α-Actin 抗体 (1A4) |
α-actin |
|
|
β-Actin (13E5) Rabbit mAb |
β-Actin |
|
|
γ-Actin 抗体 (1-17) |
γ-actin |
|
|
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb |
细胞质γ-actin |
|
|
Smooth Muscle Actin (B4) |
肠平滑肌γ-actin，平滑肌α-actin，心肌α-actin |
若使用没有标记的一抗试剂，则需要选择合适的二抗试剂来进行后续的显色，二抗的选择指南可以参考这篇文章：二抗选择超全攻略，一秒收藏！
1.2
微管蛋白
微管蛋白（Tubulin）的染色和肌动蛋白类似，固定细胞中可以使用鬼笔环肽和免疫荧光法（相关特异性抗体如下表所示）；活细胞中则可以使用特殊的荧光探针进行显色。
|
货号 |
产品 |
抗体特异性 |
|
|
α-Tubulin antibody (B-7) |
α-Tubulin |
|
|
β-Tubulin antibody (D-10) |
β-Tubulin |
部分产品推荐：
|
活细胞 |
|||
|
货号 |
产品名称 |
Abs/Em |
染色 部位 |
|
|
SiR-Actin Kit |
652/674 |
Actin |
|
|
SiR-Tubulin Kit |
652/674 |
Tubulin |
|
|
Cytoskeleton Kit |
652/674 |
SiR-Actin & SiR-Tubulin |
|
|
Actin Protein (Rhodamine): Human Platelet |
535/585 |
Actin |
|
|
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle |
535/585 |
Actin |
|
固定细胞 |
|||
|
货号 |
产品名称 |
Abs/Em |
染色部位 |
|
|
Acti-Stain 488 Phalloidin |
485/535 FITC filter set |
F-actin |
|
|
Rhodamine Phalloidin |
535/585 Rhodamine filter set |
F-actin |
细胞核
对细胞核进行染色主要是利用能与DNA相结合的染料或探针，活细胞的细胞核荧光探针，如SiR™、SPY™、Hoechst™等；固定细胞的细胞核染料：DAPI和溴化乙锭（EB）。
2.1
活细胞中细胞核的染色
图4. 使用SPY™505-DNA（绿色）和SPY555-actin（洋红色）对Hela活细胞进行复染。
部分相关荧光探针推荐：
|
货号 |
产品 |
Abs/Em |
|
|
SiR-DNA Kit |
652/674 |
|
|
SPY505-DNA |
512/531 |
|
|
SPY650-DNA |
652/674 |
|
|
SPY700-DNA |
696/718 |
2.2
固定细胞中细胞核的染色
固定细胞还可以使用免疫荧光法对细胞和进行染色定位，此时可以精确的定位到核膜和核仁，如图5(绿色荧光)所示：
图5. 免疫荧光法分别对核膜(A) / 细胞核(B) /核仁 (C) / 细胞核(剔除核仁) (D)进行染色（绿色荧光）。
图5使用的相关抗体：
|
货号 |
产品 |
染色部位 |
抗体靶标基因 |
|
|
Monoclonal Anti-LMNB1 Antibody |
Nuclear membrane |
Lamin b1 |
|
|
Monoclonal Anti-PARP1 Antibody |
Nucleus |
poly (ADP-ribose) polymerase 1 |
|
|
Monoclonal Anti-NIFK Antibody |
Nucleoli |
Nucleolar protein interacting with the fha domain of mki67 |
|
|
Monoclonal Anti-FUS Antibody |
Nuclear (without nucleoli) |
fused in sarcoma |
线粒体
线粒体是细胞中重要的功能器官，使用特定的荧光染料或探针对其进行染色，可作为细胞是否健康的重要指标之一。染料在线粒体上的积累和定位取决于线粒体膜电位，在有线粒体膜电位的健康细胞中，会显示明亮的荧光信号，而在失去线粒体膜电位的细胞中，则荧光信号弱。
3.1
活细胞中线粒体染色
为了在活细胞中对线粒体标记，也需要借助专门的荧光探针试剂。细胞将在一定浓度的特定探针中培养，接着探针通过被动扩散穿过细胞膜并在活性线粒体中积累。一旦线粒体被探针标记，细胞就可以用醛基固定剂进行处理，以便对样本进一步处理。因为MitoTracker® Red CMXRos和MitoTracker® Deep Red FM探针产生的荧光波长更长，因此适用于多重染色标记实验中。
部分相关染料推荐：
|
货号 |
产品 |
Abs (nm) |
Em (nm) |
活/固定细胞 |
|
|
MitoTracker®Green FM |
490 |
516 |
活细胞 |
|
|
LumiTracker® Mito Orange CMTMRos |
551 |
576 |
活细胞 |
|
|
MitoTracker® Red CMXRos |
579 |
599 |
活细胞 |
|
|
LumiTracker® Mito Red FM |
581 |
644 |
活细胞 |
|
|
MitoTracker® Deep Red FM |
644 |
665 |
活细胞 |
3.2
固定细胞中线粒体染色
在固定细胞中，有许多可用的线粒体标志物，常见的线粒体标志物如下表所示：
|
蛋白名称 |
基因名称 |
Uniprot ID |
|
Apoptosis-inducing factor 1 , mitochondrial |
AIFM1 |
O95831 |
|
Cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1, mitochondrial |
COX4I1 |
P13073 |
|
Carbamoyl-phosphate synthase [ammonia], mitochondrial |
CPS1 |
P31327 |
|
FAST kinase domain-containing protein 2, mitochondrial |
FASTKD2 |
Q9NYY8 |
|
Hexokinase-1 |
HK1 |
P19367 |
|
Heat shock 70 kDa protein 1A |
HSPA1A |
PODMV8 |
|
60 kDa heat shock protein, mitochondrial |
HSPD1 |
P10809 |
|
Mitochondrial dynamics protein MID51 |
MIEF1 |
Q9NQG6 |
|
Cytochrome c oxidase subunit 1 |
MT-CO1 |
P00395 |
|
NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 7, mitochondrial |
NDUFS7 |
O75251 |
|
Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM16 |
PAM16 |
Q9Y3D7 |
|
Prohibitin |
PHB |
P35232 |
|
Superoxide dismutase [Cu-Zn] |
sOD1 |
P00441 |
|
Mitochondrial import receptor subunit TOM22 homolog |
TOMM22 |
Q9NS69 |
|
Elongation factor Tu, mitochondrial |
TUFM |
P49411 |
|
Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1 |
UCP1 |
P25874 |
|
Mitochondrial uncoupling protein 2 |
UCP2 |
P55851 |
|
Mitochondrial uncoupling protein 3 |
UCP3 |
P55916 |
|
Voltage-dependent anion-selective channel protein |
VDAC1 |
P21796 |
常见的线粒体标志物
部分相关抗体推荐：
|
货号 |
蛋白名称 |
产品名称 |
应用 |
亚型 |
|
|
Tu translation elongation factor, mitochondrial |
Anti-TUFM |
ICC-IF, IHC, WB |
IgG1 |
|
|
Tu translation elongation factor, mitochondrial |
Anti-TUFM |
ICC-IF, IHC, WB |
IgG2a |
|
|
Citrate synthase |
Anti-CS |
ICC-IF, IHC, WB |
IgG1 |
|
|
Apoptosis-inducing factor 1 , mitochondrial |
AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb |
IF, IP, WB |
IgG1 |
|
|
Cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1, mitochondrial |
COX IV (3E11) Rabbit mAb |
WB,IP,IHC, IF, F |
IgG1 |
溶酶体
溶酶体是动物细胞中重要的细胞器，内部含有丰富的水解酶，其结构的完整性与生命体的生理病理均有着密切的关系。
4.1
活细胞溶酶体染色
常见的针对活细胞中溶酶体的荧光探针包括LysoTracker™系列，由于其对酸性细胞器有高度选择性（溶酶体内部pH约3.5~5），因此可以对溶酶体进行特异性染色。
相比LysoTracker™，LysoBrite™的探针在长时间追踪活细胞中的溶酶体上，具有更明显的优势。LysoBrite™染料可以在活细胞中停留超过一周，细胞毒性极小，而LysoTracker染料只能使用几个小时。且LysoBrite™染料比LysoTracker染料更具有光稳定性，如图6所示。
图6.A: LysoBrite™ Red染色, B: LysoTracker™ Red (来自Invitrogen)进行染色的Hela细胞图像。用Olympus荧光显微镜对0秒和120秒曝光时间下的信号进行比较
|
Name |
Excitation (nm) |
Emission (nm) |
|
LysoBrite™ Blue |
434 |
480 |
|
LysoBrite™ Green |
501 |
510 |
|
LysoBrite™ Red |
576 |
596 |
|
LysoBrite™ Deep Red |
597 |
619 |
|
LysoBrite™ NIR |
636 |
651 |
LysoBrite™系列探针的激发/吸收波长对比表
部分产品推荐：
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活细胞 |
|||
|
货号 |
产品名称 |
Abs/Em |
|
|
|
SiR-Lysosome Kit |
652/674 |
|
|
|
LysoTracker® Green DND-26 |
504/511 |
|
|
|
LysoBrite™ Red |
576/596 |
|
|
|
LysoBrite™ Blue |
442/353 |
|
|
固定细胞 |
|||
|
货号 |
产品名称 |
基因名称 |
应用 |
|
|
Anti-LAMP1 |
Lysosomal-associated membrane protein 1 |
IHC, WB |
内质网和高尔基体
内质网(ER)和高尔基体主要负责细胞内脂质和蛋白质的分类，因此，针对这两个细胞器的大部分染色探针都是脂质或是可以影响蛋白质运动的化学物质。在活细胞和固定细胞中，ER和高尔基体的扁平膜囊可以用各种亲脂探针进行染色，然后根据其形态进行区分。
5.1
活细胞中ER和高尔基体的染色
ER-Tracker™ 系列的染色探针针对的是活细胞，对ER具有高度选择性。这些染料很少染色线粒体，不像传统的ER染色剂DiOC6(3) (D273)，ER-Tracker™ 探针的对细胞毒性很小。当使用特定优化方案对细胞进行染色时，即使经过甲醛的处理，染色模式仍然保留。
还有一类荧光鞘脂衍生物（sphingosine derivative），如NBD C6-ceramide、BDP FL-ceramide等，也是ER/高尔基体在活细胞中的重要染色探针之一。
部分相关产品推荐：
|
活细胞 |
||||
|
货号 |
产品名称 |
Abs/Em |
染色部位 |
|
|
|
ER-Tracker™ Green (BODIPY® FL Glibenclamide) |
504/511 |
内质网 |
|
|
|
BDP TMR ceramide |
542/574 |
高尔基体 |
|
|
固定细胞 |
||||
|
货号 |
产品名称 |
基因名称 |
应用 |
染色部位 |
|
|
Anti-GORASP2 |
Golgi reassembly stacking protein 2 |
ICC-IF,IHC,WB |
高尔基体 |
|
|
Anti-PDIA3 |
Protein disulfide isomerase family A |
ICC-IF,IHC,WB |
内质网 |
|
|
Anti-HSP90B1 |
Heat shock protein 90kda beta (grp94), member 1 |
ICC-IF,IHC,WB |
内质网 |
细胞膜
细胞脂膜是动态的、流体结构(约4纳米厚)，这是生物学上的必要条件，因为若要细胞参与基本的细胞和亚细胞生理功能（如迁移、细胞扩散、吞噬、细胞分裂、内吞、机械转导和代谢等），则需要这些细胞膜/基质膜能够改变形状和张力。
6.1
活细胞中细胞膜染色
对细胞膜张力的研究在细胞生理学中很重要。荧光膜张力探针Flipper-TR®(Spirochrome, Ltd.)可以对活细胞中的膜结构进行特异性染色，以对膜的张力进行研究。如图6所示，对经历了高渗透冲击的细胞的细胞膜结构进行可视化分析。
图7. 使用Flipper-TR®探针对细胞进行染色。在高渗透冲击前(上)和冲击后(下)染色的Flipper-TR®图像。灰度表示荧光强度，彩色编码表示荧光寿命。右边的直方图显示了渗透冲击后的寿命变化。
除此之外Flipper-TR®探针还提供针对其他细胞器膜/基质膜（Plasma membrane）的染色，如溶酶体膜、线粒体膜、内质网膜。
部分相关产品推荐：
|
活细胞 |
||||
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货号 |
产品名称 |
Abs/Em |
染色部位 |
|
|
|
Flipper-TR Kit for fluorescence cell membrane microscopy |
480/600 |
细胞膜 |
|
|
|
ER Flipper-TR Kit for fluorescence cell membrane microscopy |
480/600 |
内质网膜 |
|
|
|
Lyso Flipper-TR Kit for fluorescence cell membrane microscopy |
480/600 |
溶酶体膜 |
|
|
|
Mito Flipper-TR Kit for fluorescence cell membrane microscopy |
480/600 |
线粒体膜 |
|
|
固定细胞 |
||||
|
货号 |
产品名称 |
基因名称 |
应用 |
染色部位 |
|
|
Anti-EZR |
Ezrin |
ICC-IF,IHC,WB |
Plasma membrane |
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