焦磷酸测序包括：待测序DNA单链、测序引物、dNTPs（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）、酶混合物和底物。

其中酶混合物包括：DNA聚合酶（DNA polymerase）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase)、荧光素酶（Luciferase）和双磷酸酶（apyraseAPS)和荧光素4种酶。

1) 在每一轮测序反应中，只加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，DNA聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi)，掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。

图1.焦磷酸测序过程图

2) 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，CCD感应器检测到光信号后，并由Pyro—gramIII转化为一个峰值，每个峰的高度（光信号）与反应中掺人的核苷酸数目成正比。

  图2.焦磷酸测序过程图

3) 三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）不断降解未掺入的核苷酸和ATP，淬灭光信号，再生反应体系，以此得到整个结果。

4) 加入另一种dNTP，重复第1）～3）反应。通过循环反应，根据加入的dNTP类型和荧光信号强度（峰值的高低），就可实时读取模板 DNA 的准确核苷酸序列信息。

产生的荧光信号强度表明是否有一个或多个特定的dNTP与模板成功配对，被掺入到新合成链中。峰的高低与成功掺入新链中的dNTP数量成正比，没有峰表示没有dNTP成功掺入，1倍高度的峰表示1个dNTP成功掺入，2倍高度的峰表示2个dNTP成功掺入，3倍高度的峰表示3个dNTP成功掺入。总的来说，通过信号峰的有无判断碱基的种类，峰高则可以判断连续掺入的碱基的数目,或是对群体样本中不同基因型所占的比例加以定量。下图中，横坐标代表加入的碱基顺序，纵坐标代表荧光信号强度。

图3.焦磷酸测序结果图

(1) 不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素；

(2) 每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析，实验设计灵活；

(3) 与传统的Sanger测序相比，焦磷酸测序具有更高的灵敏度和准确性。

SNP位点检测：焦磷酸测序技术在检测SNP时只要根据已知序列设计一对扩增含SNP位点的PCR引物和一个测定SNP类型的测序引物即可。

多重SNP分析：是焦磷酸测序技术在该领域应用中的又一发展，可以在同一个反应孔中分析几个SNP和插入/缺失多态性，PCR产物既可以单独扩增，在基因型分析前混合，也可以采用多重PCR一起进行扩增。

SNP频率分析：由于焦磷酸测序法是基于碱基逐个延伸的原理进行测序，且产生的信号强度没有碱基种类上的差异不是很大，因此因此这就要求测定方法灵敏、精确、可靠。

HLA基因型分析：焦磷酸测序技术之所以能够实现高分辨率心基因分型，是由于该技术实现了以实现异相核苷酸掺人方式，这样可以在较短时间内分辨HLA-DQ和HLA-A/B等位基因组合。

肿瘤基因甲基化研究:焦磷酸测序技术能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测。用焦磷酸测序技术检测基因甲基化水平，常用重亚硫酸盐将基因组DNA中的未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变，在以后的PCR扩增中，尿嘧啶将变成胸腺嘧啶，因此甲基化位点就成为一个普通的C/T单碱基多态性位点，其中等位基因C的频率即为基因甲基化的程度，它的基因频率为0%～100%。

除以上应用之外，焦磷酸测序技术还可以用于人cDNA文库分析、基因组DNA中的单倍型分析和法医鉴定等场景。

好啦，今天的分享就到这里，我也相信小伙伴们应该对焦磷酸测序技术有了一定的了解！