高通量测序技术的出现,使获得核酸序列数据的单碱基测序费用相对于Sanger测序急剧下降,随之也给基因组学研究带来了更多新方法和新方案[1]。在基因组测序、转录组测序、宏基因组测序、表观遗传测序、外显子捕获测序、靶区域测序等诸多科研及精准医疗检测领域内有广泛的运用。
高通量测序实验的基础就是一个片段长度符合要求并且连接上接头的文库,具体文库构建的具体过程,之前在我们公众号中文库构建,根本没你想的那么难这篇文章中有过详细的介绍,有需要的小伙伴可以点击查看。
文库构建中的接头是这一步非常关键的产品,接头的选择很有讲究。现在主流的二代测序平台主要是illumina®和MGI®,但这两个平台所使用的接头也并不相同,那么我们到底应该怎么选择呢?接下来我会以illumina®平台的接头为例来跟大家简单介绍。
illumina®平台使用的是“Y”型接头,但是根据应用场景的不同,可以大致分为以下几种类型。
这个就是最常规的Y型接头,两边黑色的P5和P7序列,它们的主要作用是可以使建好的文库通过PCR的方式固定到测序芯片上。接下来就是UMI,UMI的全称为Unique Molecular Identifier,也就是我们说的特异分子标签。这个标签可以看作是分子的“条形码”,主要用于标记原始样本中的分子,对于同一来源的扩增产物进行追踪和分组,用于排除PCR过程中扩增过程中的偏好性。i5 index和i7 index就是我们经常说的标签分子序列,主要是用来区分不同的文库序列。
这种类型的接头也可以叫做“小Y字形接头”顾名思义就是将原来的大Y型(长接头)改短了,这样的改动是把index序列放到了第二次扩增的引物上。这样修改最大的好处在于不同样本连接接头时,不需要根据样本的数量准备多条长接头,而是可以全部用同一管的短接头,这样可以完全不必担心交叉污染的问题而且也可以大幅度的降低成本。还有一种情况就是多人分别建库的时候,使用的index重复了,这样只要还保留着连接产物,即可快速的扩增,得到可用的文库。
那UDI是做什么的呢,UDI就是Unique Dual Index,是指双端唯一index序列。这样的接头可以降低测序过程中和实验过程中引入的交叉污染,避免测序数据的错误。
这类的接头先用第一轮的PCR反应,是DNA片段特异性上下游引物分别携带了部分的Read1和部分的Read2;第二轮PCR之后,P5、P7接头被补齐,接下来就可以上机测序了。这类接头同样带有UMI,可以用于检验低频突变。
这种类型的接头也可以叫做“小Y字形接头”,顾名思义就是将原来的大Y型(长接头)改短了,这样的改动是把index序列放到了第二次扩增的引物上。这样修改最大的好处在于不同样本连接接头时,不需要根据样本的数量准备多条长接头,而是可以全部用同一管的短接头,这样可以完全不必担心交叉污染的问题而且也可以大幅度的降低成本。还有一种情况就是多人分别建库的时候,使用的index重复了,这样只要还保留着连接产物,即可快速的扩增,得到可用的文库。
那UDI是做什么的呢,UDI就是Unique Dual Index,是指双端唯一index序列。这样的接头可以降低测序过程中和实验过程中引入的交叉污染,避免测序数据的错误。
生工生物工程(上海)股份有限公司自2011年成立高通量测序部以来,逐步引进了Illumina,Life,DNBSEQ,PacBio、Nanopore、等二代/三代测序平台。建立了2000平米高标准实验室(通过了国家ISO认证)并搭建了50PB级存储及运算能力的服务器集群,能满足绝大多数科研客户的研究需要。同时,生工高通量测序团队建设也在不断完善中,目前有100余专职员工,其中高级技术人员以及高级生物信息工程师占比50%以上,10年来,通过生工高通量测序服务所发表的文章累计影响因子在10000分以上。
生工现在可以提供illumina®平台的UDI和UMI接头和MGI®平台的UDB和UMI接头,欢迎致电沟通洽谈。
联系方式:021-5707 2413。
参考文献
1. 岳桂东, 高强, 罗龙海, 等. 高通量测序技术在动植物研究领域中的应用[J]. 中国科学:生命科学,2012,42(2):107-124.
文章部分内容参考CSDN博客小余吐泡泡《illumina平台的测序接头》