文末一键获取WB实验超全技巧
蛋白糖基化是一种非常重要而且广泛的蛋白质翻译后修饰方式，在所有的已知蛋白质中，约有50%是被糖基化的蛋白质。哺乳动物中的糖链大约有7000+种结构，大大扩展了蛋白质组。糖基化在细胞信号传导、细胞黏附和识别、蛋白稳定性、蛋白功能调节扮演着关键角色。WB也是研究糖基化修饰的常用实验，那么我们在检测的时候应该注意哪些细节呢，今天小优细节君来和大家一起探讨一下。
分子量偏移
糖基化修饰会增大分子量，这个大家都很容易理解，但是不同样本，相同样本不同刺激处理的糖基化增加的分子量并非固定值。同一蛋白上的糖基化位点可能连接不同长度、分支结构和糖基组成的糖链（如高甘露糖型、杂合型、复杂型），导致分子量存在差异。还有大体积糖链可能阻碍SDS与蛋白结合，导致SDS包裹不均匀，迁移速度不一致，呈现出表观分子量不一致。例如下图的MUC1蛋白，属于高度糖基化蛋白，理论分子量只有120kd，但在糖基化修饰后，分子量可达到400kd左右，因为含有大量的O-糖基化位点，导致糖链占比非常大。
来自CSThttps://www.univ-bio.com/search.html?keyword=14161&mk_channel=WXktzj#14161
下图的EGFR理论分子量是134kd，由于有10+个N-糖基化位点，实际分子量可达到175-180kd，增加~40kd。
来自CSThttps://www.univ-bio.com/search.html?keyword=4267&mk_channel=WXktzj#4267
所以，我们在检测糖基化修饰的蛋白的时候，一定要把膜裁宽一些，第一次做可以做个全膜，确认条带位置，再进行重复实验。
糖苷酶的选择
单纯依靠分子量偏移不足以确认糖基化，必须设计糖苷酶对照实验。糖苷酶的选择要看糖基的连接方式，例如与Asn侧链的酰胺键相连（N-糖基化），与Ser、Thr、羟基赖氨酸（胶原）或Tyr（糖原蛋白）的羟基相连（O-糖基化），或通过C-C键连接到Trp的C2位置（C-甘露糖基化）。另外，还可以通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚间接与蛋白质相连。
N-糖基化是真核生物中最普遍的糖基化形式，推荐使用PNGase F，PNGase F处理后的样本应显示分子量降低。如果是O-糖基化，应使用 O-糖苷酶，不过这个酶特异性没有PNGase F高，一般是混合酶，使用前需要对样本进行处理。
来自CSThttps://www.univ-bio.com/search.html?keyword=52749&mk_channel=WXktzj#52749
有小伙伴要问了，那我怎么知道我的蛋白发生什么糖基化了。这个很简单，我们通过Uniprot-PTM，就可以查看具体发生糖基化的类型了。
条带形状
很多小伙伴问，为什么我的条带是粗粗的，非常模糊，还有拖尾，看起来像样本降解，问怎么优化实验。其实这都是糖基化修饰条带正常的现象，如果条带趋势符合预期，无需再优化。如果条带过粗，可以尝试减少上样量和抗体浓度。如果严重拖尾，我们可以尝试使用梯度胶+低压电泳的办法，尽可能减少拖尾现象。
来自CSThttps://www.univ-bio.com/search.html?keyword=8238&mk_channel=WXktzj#8238
样本制备
关于样本制备，网上说法不一，有人说应该充分变性，有人说要不煮样，那么到底应该怎么处理呢，今天我们来讨论一下。
对于高度糖基化的蛋白，糖链非常多，我们确实应该要充分变性，暴露出抗原位点，这样抗体才能结合。可能普通的RIPA裂解液还不够，还需要加SDS或者尿素等充分变性。糖基化修饰的蛋白大部分为膜蛋白，膜蛋白如果高温煮样又容易聚集影响电泳，所以可以尝试低温煮样，或者不煮样，加上超声处理。
有小伙伴要问了，不煮样如何充分变性呢？其实这两点并不矛盾，化学变性也是变性，我们可以适当降低煮样温度（37度或者70度），提高裂解液中的变性成分（尿素等）使蛋白充分变性。还有最重要一点，不同的蛋白需要做预实验来摸索最佳条件，切勿用一个条件来做所有蛋白。
最后，总结一下糖基化WB需要注意的点：
❖
全膜保证目的蛋白不丢失
❖
糖苷酶验证特异性
❖
电泳改善模糊拖尾
❖
样本制备需充分变性
参考文献：
1. Eichler J. Protein glycosylation. Curr Biol. 2019 Apr 1;29(7):R229-R231.
2. Stowell SR, Ju T, Cummings RD. Protein glycosylation in cancer. Annu Rev Pathol. 2015;10:473-510.
📚https://www.univ-bio.com/study-center/literatureList.html?mk_channel=WXktzj点此直达【文献中心】：超百万高质量文献数据，每月5万+持续更新！
